Omprogrammering - Reprogramming
Inom biologin avser omprogrammering radering och ombyggnad av epigenetiska märken, såsom DNA -metylering , under däggdjursutveckling eller i cellodling. Sådan kontroll är också ofta associerad med alternativa kovalenta modifieringar av histoner .
Omprogrammeringar som är både storskaliga (10% till 100% av epigenetiska märken) och snabba (timmar till några dagar) sker vid tre livsfaser hos däggdjur. Nästan 100% av epigenetiska märken omprogrammeras under två korta perioder tidigt i utvecklingen efter befruktning av ett ägg av en sperma . Dessutom kan nästan 10% av DNA -metyleringarna i neuroner i hippocampus snabbt förändras under bildandet av ett starkt rädsleminne.
Efter befruktning hos däggdjur raderas DNA-metyleringsmönster till stor del och återetableras sedan under tidig embryonal utveckling. Nästan alla metyleringar från föräldrarna raderas, först under tidig embryogenes , och igen i gametogenes , med demetylering och remetylering som förekommer varje gång. Demetylering under tidig embryogenes sker under preimplantationsperioden. Efter att en sperma befruktar ett ägg för att bilda en zygote sker snabb DNA -demetylering av faderns DNA och långsammare demetylering av moderns DNA tills bildandet av en morula som nästan inte har någon metylering. Efter att blastocysten har bildats kan metylering påbörjas, och med epiblastens bildning sker en metyleringsvåg fram till embryonets implantationsstadium. Ytterligare en period av snabb och nästan fullständig demetylering sker under gametogenes inom de ursprungliga könscellerna (PGC). Andra än PGC: erna, efter implantationen, är metyleringsmönster i somatiska celler steg- och vävnadsspecifika med förändringar som förmodligen definierar varje enskild celltyp och varar stabilt under lång tid.
Embryonisk utveckling
Musen spermier genomet är 80-90% denaturerad vid sina CpG-säten i DNA, som uppgår till cirka 20 miljoner metylerade platser. Efter befruktning demetyleras faderns kromosom nästan helt på sex timmar med en aktiv process, innan DNA -replikation (blå linje i figur). I den mogna äggcellen metyleras cirka 40% av dess CpG -ställen. Demetylering av moderkromosomen sker i stor utsträckning genom att metyleringsenzymerna blockeras från att verka på maternalt ursprung och genom utspädning av det metylerade moderns DNA under replikation (röd linje i figur). Den morula (vid 16 cellstadiet), har endast en liten mängd av DNA-metylering (svart linje i figur). Metylering börjar öka 3,5 dagar efter befruktning i blastocysten , och en stor våg av metylering sker sedan på dagarna 4,5 till 5,5 i epiblasten , går från 12% till 62% metylering och når maximal nivå efter implantation i livmodern. Vid dag sju efter befruktning segregerar de nybildade urkimcellerna (PGC) i det implanterade embryot från de återstående somatiska cellerna . Vid denna tidpunkt har PGC: erna ungefär samma metyleringsnivå som de somatiska cellerna.
De nybildade urkimcellerna (PGC) i det implanterade embryot avgår från de somatiska cellerna. Vid denna tidpunkt har PGC: erna höga metyleringsnivåer. Dessa celler migrerar från epiblasten mot gonadala åsen . Nu sprider sig cellerna snabbt och börjar demetylering i två vågor. I den första vågen sker demetylering genom replikativ utspädning, men i den andra vågen sker demetylering genom en aktiv process. Den andra vågen leder till demetylering av specifika loci. Vid denna tidpunkt visar PGC -genomerna de lägsta nivåerna av DNA -metylering av alla celler i hela livscykeln [på embryonala dagen 13.5 (E13.5), se den andra figuren i detta avsnitt].
Efter befruktning migrerar vissa celler i det nybildade embryot till den germinala åsen och kommer så småningom att bli könsceller (spermier och oocyter) i nästa generation. På grund av fenomenet genomisk prägling är moderns och faderns genomers differentiellt markerade och måste omprogrammeras ordentligt varje gång de passerar genom könscykeln. Under gametogenes måste därför de ursprungliga könscellerna ha sina ursprungliga biparentala DNA-metyleringsmönster raderade och återupprättade baserat på könet hos den överförande föräldern.
Efter befruktning demetyleras faderns och moderns genom för att radera sina epigenetiska signaturer och förvärva totipotens. Det finns asymmetri vid denna punkt: den manliga pronucleus genomgår en snabb och aktiv demetylering. Under tiden demetyleras kvinnlig pronucleus passivt under på varandra följande celldelningar. Processen med DNA-demetylering involverar basexcisionsreparation och troligen andra DNA-reparationsbaserade mekanismer. Trots den globala karaktären hos denna process finns det vissa sekvenser som undviker den, såsom differentiellt metylerade regioner (DMRS) associerade med påtryckta gener, retrotransposoner och centromeriskt heterokromatin . Remetylering behövs igen för att differentiera embryot till en komplett organism.
In vitro- manipulation av pre-implantationsembryon har visat sig störa metyleringsmönster på präglade loci och spelar en avgörande roll hos klonade djur.
Inlärning och minne
Inlärning och minne har nivåer av beständighet, som skiljer sig från andra mentala processer som tanke, språk och medvetande, som är tillfälliga. Inlärning och minne kan antingen ackumuleras långsamt (multiplikationstabeller) eller snabbt (vidröra en het spis), men när det väl uppnåtts kan det återkallas till medvetet bruk under lång tid. Råttor som utsätts för en förekomst av kontextuell rädsla konditionering skapar ett särskilt starkt långsiktigt minne. 24 timmar efter träning befanns 9,17% av generna i råttgenomen hos hippocampusneuroner vara differentiellt metylerade . Detta inkluderade mer än 2000 differentiellt metylerade gener vid 24 timmar efter träning, med över 500 gener som demetylerades. Hippocampusregionen i hjärnan lagras där kontextuella rädsminnen först lagras (se hjärnans figur, detta avsnitt), men denna lagring är övergående och förblir inte i hippocampus. Hos råttor avskaffas kontextuell rädsla konditionering när hippocampus utsätts för hippocampektomi bara 1 dag efter konditionering, men råttor behåller en betydande mängd kontextuell rädsla när en lång fördröjning (28 dagar) införs mellan konditioneringstiden och tiden för hippocampektomi.
Molekylära stadier
Tre molekylära steg krävs för omprogrammering av DNA -metylomen . Steg 1: Rekrytering. De enzymer som behövs för omprogrammering rekryteras till genomplatser som kräver demetylering eller metylering. Steg 2: Implementering. De första enzymatiska reaktionerna äger rum. När det gäller metylering är detta ett kort steg som resulterar i metylering av cytosin till 5-metylcytosin. Steg 3: Bas -excision -DNA -reparation. Mellanprodukterna av demetylering katalyseras av specifika enzymer i bas -excision -DNA -reparationsvägen som slutligen återställer cystosin i DNA -sekvensen.
Figuren i detta avsnitt indikerar de centrala rollerna för tio-elva translokationsmetylcytosindioxygenaser (TET) i demetyleringen av 5-metylcytosin för att bilda cytosin. Som granskat 2018 oxideras 5mC initialt mycket ofta av TET-dioxygenaser för att generera 5-hydroximetylcytosin (5hmC). I successiva steg (se figur) hydroxilerar TET-enzymer ytterligare 5hmC för att generera 5-formylcytosin (5fC) och 5-karboxylcytosin (5caC). Tymin-DNA-glykosylas (TDG) känner igen de mellanliggande baserna 5fC och 5caC och skär ut den glykosidiska bindningen som resulterar i ett apyrimidiniskt ställe (AP- ställe ). I en alternativ oxidativ deamineringsväg kan 5hmC oxidativt deamineras av APOBEC (AID/APOBEC) deaminaser för att bilda 5-hydroximetyluracil (5hmU) eller 5mC kan omvandlas till tymin (Thy). 5hmU kan klyvas av TDG, SMUG1 , NEIL1 eller MBD4 . AP -ställen och T: G -missmatchningar repareras sedan med basexcisionsreparationsenzymer (BER) för att ge cytosin (Cyt).
TET -familjen
Isoformerna för TET -enzymerna innefattar minst två isoformer av TET1, en av TET2 och tre isoformer av TET3. Den kanoniska TET1-isoformen i full längd verkar praktiskt taget begränsad till tidiga embryon, embryonala stamceller och primordiala könsceller (PGC). Den dominerande TET1 -isoformen i de flesta somatiska vävnader, åtminstone i musen, härrör från alternativ promotoranvändning som ger upphov till ett kort transkript och ett avkortat protein betecknat TET1s. Isoformerna för TET3 är TET3FL i full längd, en TET3 -variant med korta skarvvarianter och en form som förekommer i oocyter och neuroner betecknade TET3o. TET3o skapas genom alternativ promotoranvändning och innehåller ytterligare en första N-terminal exon som kodar för 11 aminosyror. TET3o förekommer endast i oocyter och neuroner och uttrycktes inte i embryonala stamceller eller i någon annan celltyp eller vuxen musvävnad som testades. Medan TET1-uttryck knappt kan detekteras i oocyter och zygoter, och TET2 endast uttrycks måttligt, visar TET3-varianten TET3o extremt höga uttrycksnivåer i oocyter och zygoter, men är nästan frånvarande i 2-cellstadiet. Det är möjligt att TET3o, hög i neuroner, oocyter och zygoter vid ett cellstadium, är det huvudsakliga TET -enzymet som används när mycket snabba demetyleringar sker i dessa celler.
Rekrytering av TET till DNA
De TET enzymerna inte specifikt binder till 5-metylcytosin utom när rekryteras. Utan rekrytering eller inriktning, TET1 övervägande binder till höga CG promotorer och CpG-öar (CGI) genomet-brett och dess CXXC domän som kan känna igen un-metylerade CGI. TET2 har ingen affinitet för 5-metylcytosin i DNA. CXXC-domänen för TET3 i full längd, som är den dominerande formen uttryckt i neuroner, binder starkast till CpG där C omvandlades till 5-karboxycytosin (5caC). Det binder dock också till ometylerade CpG .
För att ett TET -enzym ska initiera demetylering måste det först rekryteras till ett metylerat CpG -ställe i DNA. Två av de proteiner som visat sig rekrytera ett TET -enzym till ett metylerat cytosin i DNA är OGG1 (se figur Initiering av DNA -demthylering) och EGR1 .
OGG1
Oxoguaninglykosylas (OGG1) katalyserar det första steget i basexcisionsreparation av den oxidativt skadade basen 8-OHdG . OGG1 hittar 8-OHdG genom att glida längs det linjära DNA vid 1000 baspar DNA på 0,1 sekunder. OGG1 hittar mycket snabbt 8-OHdG. OGG1 -proteiner binder till oxidativt skadat DNA med en halv maxtid på cirka 6 sekunder. När OGG1 hittar 8-OHdG ändrar det konformation och komplex med 8-OHdG i bindningsfickan på OGG1. OGG1 agerar inte omedelbart för att ta bort 8-OHdG. Halv maximalt avlägsnande av 8-OHdG tar cirka 30 minuter i HeLa-celler in vitro , eller cirka 11 minuter i lever av bestrålade möss. DNA-oxidation av reaktiva syrearter sker företrädesvis vid en guanin i ett metylerat CpG-ställe på grund av en sänkt joniseringspotential hos guaninbaser intill 5-metylcytosin. TET1 binder (rekryteras till) OGG1 bunden till 8-OHdG (se figur). Detta tillåter troligen TET1 att demetylera ett intilliggande metylerat cytosin. När humana bröstepitelceller (MCF-10A) behandlades med H 2 O 2 , 8-OHdG ökade i DNA genom 3,5-faldigt och detta orsakade storskalig demetylering av 5-metylcytosin till ca 20% av sin ursprungliga nivå i DNA.
EGR1
Genens tidiga tillväxtresponsprotein 1 ( EGR1 ) är en omedelbar tidig gen (IEG). Det avgörande kännetecknet för IEG är den snabba och övergående uppregleringen-inom några minuter-av deras mRNA-nivåer oberoende av proteinsyntes. EGR1 kan snabbt induceras av neuronal aktivitet. I vuxen ålder uttrycks EGR1 i stor utsträckning i hela hjärnan och bibehåller baslinjeuttrycksnivåer i flera nyckelområden i hjärnan, inklusive den mediala prefrontala cortex, striatum, hippocampus och amygdala. Detta uttryck är kopplat till kontroll av kognition, känslomässigt svar, socialt beteende och känslighet för belöning. EGR1 binder till DNA på ställen med motiven 5′-GCGTGGGCG-3 'och 5'-GCGGGGGCGG-3' och dessa motiv förekommer främst i promotorregioner av gener. De korta isoform TET1 uttrycks i hjärnan. EGR1 och TET1 bildar ett komplex som medieras av de C-terminala regionerna i båda proteinerna, oberoende av associering med DNA. EGR1 rekryterar TET1 till genomiska regioner som flankerar EGR1 -bindningsställen. I närvaro av EGR1 kan TET1s lokalisera specifik demetylering och aktivera uttrycket av nedströms gener reglerade av EGR1.
I cellodlingssystem
Omprogrammering kan också induceras artificiellt genom introduktion av exogena faktorer, vanligtvis transkriptionsfaktorer . I detta sammanhang hänvisar det ofta till skapandet av inducerade pluripotenta stamceller från mogna celler såsom vuxna fibroblaster . Detta möjliggör produktion av stamceller för biomedicinsk forskning , till exempel forskning om stamcellsterapier , utan användning av embryon. Det utförs genom transfektion av stamcellsassocierade gener till mogna celler med användning av virusvektorer såsom retrovirus .
Historia
Den första personen som framgångsrikt demonstrerade omprogrammering var John Gurdon , som 1962 visade att differentierade somatiska celler kunde omprogrammeras tillbaka till ett embryontillstånd när han lyckades få simmande grodyngel efter överföringen av differentierade tarmepitelceller till enucleterade grodägg. För denna prestation fick han Nobelpriset i medicin 2012 tillsammans med Shinya Yamanaka . Yamanaka var den första som visade (2006) att denna somatiska cellkärnöverföring eller oocytbaserad omprogrammeringsprocess (se nedan), som Gurdon upptäckte, kan rekapituleras (hos möss) med definierade faktorer (4 oktober , Sox2 , Klf4 och c -Myc ) för att generera inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). Andra kombinationer av gener har också använts.
Variabilitet
Egenskaperna hos celler som erhållits efter omprogrammering kan variera betydligt, särskilt bland iPSC. Faktorer som leder till variation i prestandan vid omprogrammering och funktionella egenskaper hos slutprodukter inkluderar genetisk bakgrund, vävnadskälla, omprogrammeringsfaktor stökiometri och stressorer relaterade till cellodling.
Somatisk cellkärnöverföring
En äggstock kan omprogrammera en vuxen kärna till ett embryonalt tillstånd efter somatisk cellkärnöverföring , så att en ny organism kan utvecklas från en sådan cell.
Omprogrammering skiljer sig från utvecklingen av en somatisk epitype , eftersom somatiska epitypes potentiellt kan ändras efter att en organism har lämnat livets utvecklingsstadium. Under somatisk cellkärnöverföring stänger äggcellen av vävnadsspecifika gener i den somatiska cellkärnan och slår tillbaka på embryon specifika gener.
