Újraprogramozás - Reprogramming
A biológiában az újraprogramozás az epigenetikai jelek, például a DNS -metilezés törlésére és átalakítására vonatkozik, emlősfejlődés vagy sejtkultúra során. Az ilyen szabályozás gyakran társul a hisztonok alternatív kovalens módosításaival is .
Az emlősök három életszakaszában nagy léptékű (10–100% -os epigenetikai jelek) és gyors (órák és néhány nap) közötti átprogramozások fordulnak elő. Az epigenetikai jelek majdnem 100% -a két rövid időszak alatt, a petesejt spermiummal történő megtermékenyítése után, két rövid időszak alatt átprogramozódik . Ezenkívül a hippokampusz idegsejtjeiben a DNS -metilációk közel 10% -a gyorsan megváltoztatható egy erős félelemmemória kialakulása során.
Az emlősök megtermékenyítése után a DNS-metilezési minták nagyrészt törlődnek, majd a korai embrionális fejlődés során újra létrejönnek. Szinte az összes metilációk a szülők törlődik, először a korai embriogenezis , és újra ivarsejtszaporodásra , a demetilezés és remethylation előforduló minden egyes alkalommal. A demetiláció a korai embriogenezis során a beültetés előtti időszakban következik be. Miután a sperma megtermékenyíti a petesejtet, hogy zigótát képezzen , az apai DNS gyors DNS -demetilezése és az anyai DNS lassabb demetilációja következik be, amíg egy olyan morula képződik, amely szinte nem metilál. A blasztociszták kialakulása után megkezdődhet a metilezés, és az epiblaszt kialakulásával a metilezés hulláma következik be az embrió beültetési szakaszáig. Tovább időszak gyors és szinte teljes demetilációval bekövetkezik gametogenezis belül primordiális csírasejtek (PGC). A PGC-k kivételével a beültetés utáni szakaszban a szomatikus sejtek metilezési mintái stádium- és szövetspecifikusak, változásokkal, amelyek feltehetően meghatározzák az egyes sejttípusokat, és hosszú ideig stabilak.
Embrionális fejlődés
Az egér spermium genomja 80–90% -ban metilált a CpG -helyeken a DNS -ben, körülbelül 20 millió metilezett helyet. A megtermékenyítés után az apai kromoszóma hat óra alatt szinte teljesen demetileződik egy aktív eljárással, a DNS replikációja előtt (kék vonal az ábrán). Az érett petesejtekben a CpG helyek mintegy 40% -a metilezett. Az anyai kromoszóma demetilezése nagyrészt úgy történik, hogy a metilező enzimek blokkolják az anyai eredetű DNS-t, és a metilált anyai DNS-t a replikáció során hígítják (vörös vonal az ábrán). A morula (a 16 sejt stádiumában) csak kis mennyiségű DNS -metilezést tartalmaz (fekete vonal az ábrán). A metiláció a blasztocisztában történő megtermékenyítés után 3,5 nappal kezd növekedni, majd a metiláció nagy hulláma következik be a 4,5-5,5 napon az epiblasztban , 12% -ról 62% -ra metilálva, és a méhbe történő beültetés után eléri a maximális szintet. A megtermékenyítés utáni hetedik napon a beültetett embrióban újonnan kialakult őscsíra -sejtek (PGC) elkülönülnek a fennmaradó szomatikus sejtektől . Ezen a ponton a PGC -k körülbelül ugyanolyan szintű metilezéssel rendelkeznek, mint a szomatikus sejtek.
A beültetett embrióban újonnan kialakult őscsíra -sejtek (PGC) a szomatikus sejtekből származnak. Ezen a ponton a PGC -k magas metilációs szinttel rendelkeznek. Ezek a sejtek az epiblasztból a nemi nemi gerinc felé vándorolnak . Most a sejtek gyorsan szaporodnak, és két hullámban megkezdik a demetilációt. Az első hullámban a demetilezés replikatív hígítással történik, de a második hullámban a demetiláció aktív folyamat. A második hullám specifikus lókuszok demetilációjához vezet. Ezen a ponton a PGC genomok mutatják a legalacsonyabb DNS -metilezési szintet a sejtekben az egész életciklusban [az embrionális napon 13,5 (E13,5), lásd a második ábrát ebben a szakaszban].
A megtermékenyítés után az újonnan kialakult embrió egyes sejtjei a csíragerincre vándorolnak, és végül a következő generáció csírasejtjeivé (spermiumok és petesejtek) válnak . A genomiális lenyomat jelensége miatt az anyai és apai genomok megkülönböztetetten vannak megjelölve, és minden alkalommal megfelelően át kell programozni őket, amikor áthaladnak a csíravonalon. Ezért a gametogenezis folyamata során az őscsírasejteknek törölniük kell az eredeti kétoldalú DNS-metilációs mintázatukat, és újra kell alakítaniuk az átadó szülő neme alapján.
A megtermékenyítés után az apai és anyai genomokat demetilezik, hogy töröljék epigenetikus aláírásaikat és elnyerjék a totipotenciát. Ezen a ponton aszimmetria figyelhető meg: a hím pronukleusz gyors és aktív demetiláción megy keresztül. Eközben a női pronucleus passzív módon demetilálódik az egymást követő sejtosztódások során. A DNS-demetilezés folyamata magában foglalja a bázis kivágását és valószínűleg más DNS-javításon alapuló mechanizmusokat. Ennek a folyamatnak a globális jellege ellenére vannak bizonyos szekvenciák, amelyek ezt elkerülik, mint például a lenyomatolt génekhez, a retrotranszpozonokhoz és a centromer heterokromatinhoz kapcsolódó differenciálisan metilezett régiók (DMRS) . Ismét remetilezésre van szükség ahhoz, hogy az embriót teljes organizmussá differenciálják.
Kimutatták, hogy az implantáció előtti embriók in vitro manipulációja megzavarja a metilezési mintákat a lenyomatolt lókuszokon, és döntő szerepet játszik a klónozott állatokban.
Tanulás és memória
A tanulás és a memória állandósági szintjei eltérnek más mentális folyamatoktól, mint például a gondolkodás, a nyelv és a tudat, amelyek átmeneti jellegűek. A tanulás és a memória vagy lassan halmozható fel (szorzótáblák), vagy gyorsan (megérintve a forró kályhát), de ha elértük, akkor sokáig vissza lehet hívni a tudatos használatba. A kontextuális félelem kondicionálás egy példányának kitett patkányok különösen erős hosszú távú memóriát hoznak létre. 24 órával az edzés után a hippocampus neuronok patkány genomjaiban található gének 9,17% -át differenciáltan metilezték . Ez több mint 2000 különböző metilált gént tartalmazott 24 órával az edzés után, és több mint 500 gént demetileztek. Az agy hippocampus régiója az, ahol először tárolódnak a kontextuális félelmek emlékei (lásd az agy ábráját, ez a szakasz), de ez a tárolás átmeneti, és nem marad a hippocampusban. Patkányokban a környezeti félelem kondicionálása megszűnik, ha a hippocampus -t csak 1 nappal a kondicionálás után hippocampectomiának vetik alá, de a patkányok jelentős mennyiségű kontextuális félelmet tartanak fenn, ha hosszú (28 napos) késleltetést írnak elő a kondicionálás és a hippocampectomia között.
Molekuláris szakaszok
A DNS -metilóm újraprogramozásához három molekuláris szakasz szükséges . 1. szakasz: toborzás. Az újraprogramozáshoz szükséges enzimeket olyan genomhelyekre toborozzák, amelyek demetilezést vagy metilezést igényelnek. 2. szakasz: Végrehajtás. A kezdeti enzimatikus reakciók lejátszódnak. A metilezés esetében ez egy rövid lépés, amelynek eredményeként a citozin 5-metil-citozinná metilálódik. 3. szakasz: Alapkimetszés DNS javítása. A demetilezés közbenső termékeit a bázis kimetszéses DNS -javítási útvonal specifikus enzimei katalizálják, amelyek végül visszaállítják a cisztozin DNS -szekvenciáját.
Az ebben a szakaszban látható ábra tíz-tizenegy transzlokációs metil - citozin-dioxigénáz (TET) központi szerepét mutatja be az 5-metil-citozin citozin-demetilezésében. A 2018-as felülvizsgálat szerint az 5 mC-t kezdetben nagyon gyakran a TET-dioxigenázok oxidálják, hogy 5-hidroxi-metil- citozint (5hmC) állítsanak elő. Az egymást követő lépésekben (lásd az ábrát) a TET enzimek tovább hidroxilezik az 5hmC-t, hogy 5-formil-citozint (5fC) és 5-karboxil-citozint (5caC) állítsanak elő. A timin-DNS glikoziláz (TDG) felismeri az 5fC és 5caC köztes bázisokat, és kivágja a glikozidos kötést, ami apyrimidinic helyet (AP helyet) eredményez. Egy alternatív oxidatív dezaminálási reakcióút, 5hmC lehet oxidatív dezaminálhatók APOBEC (AID / APOBEC) dezaminázok alkotnak amelyet 5-hidroxi (5hmU) vagy 5mC átalakítható timin (Thy). Az 5hmU lehasítható TDG, SMUG1 , NEIL1 vagy MBD4 segítségével . Az AP helyeket és a T: G eltéréseket ezután kijavítják bázis kimetszés javító (BER) enzimekkel, hogy citozint (Cyt) kapjanak.
TET család
A TET enzimek izoformái legalább két TET1 izoformát, egyet a TET2 és három TET3 izoformát tartalmaznak. A teljes hosszúságú kanonikus TET1 izoforma gyakorlatilag a korai embriókra, embrionális őssejtekre és őscsíra-sejtekre (PGC) korlátozódik. A domináns TET1 izoforma a legtöbb szomatikus szövetben, legalábbis az egérben, az alternatív promóterhasználatból származik, amely rövid átiratot és TET1 -nek nevezett csonka fehérjét eredményez. A TET3 izoformái a teljes hosszúságú TET3FL forma, a TET3s rövid formájú illesztési variáns, és a TET3o jelzésű forma, amely a petesejtekben és a neuronokban fordul elő. A TET3o alternatív promóter használatával jön létre, és tartalmaz egy további első N-terminális exont, amely 11 aminosavat kódol. A TET3o csak petesejtekben és idegsejtekben fordul elő, embrionális őssejtekben vagy más vizsgált sejttípusban vagy felnőtt egérszövetben nem expresszálódott. Míg a TET1 expresszió alig mutatható ki petesejtekben és zigótákban, és a TET2 csak mérsékelten expresszálódik, a TET3o TET3o variáns rendkívül magas expressziós szintet mutat a petesejtekben és a zigótákban, de majdnem hiányzik a 2-sejtes stádiumban. Lehetséges, hogy a TET3o, amely magas az idegsejtekben, petesejtekben és zigótákban egy sejtfázisban, a fő TET -enzim, amelyet akkor használnak, ha ezekben a sejtekben nagyon nagy léptékű gyors demetiláció történik.
TET toborzása DNS -be
A TET enzimek nem kötődnek specifikusan az 5-metil-citozinhoz, kivéve, ha toborozzák. Toborzás vagy célzás nélkül a TET1 túlnyomórészt a magas CG-promoterekhez és a CpG-szigetekhez (CGI-k) kötődik genomszintre a CXXC doménje révén, amely képes felismerni a metilálatlan CGI - ket . A TET2-nek nincs affinitása az 5-metil-citozinhoz a DNS-ben. A teljes hosszúságú TET3 CXXC doménje, amely az idegsejtekben kifejezett uralkodó forma, a legerősebben kötődik a CpG-khez, ahol a C 5-karboxi-citozinná (5caC) alakult át. Ugyanakkor kötődik a metilálatlan CpG-khez is .
Ahhoz, hogy a TET enzim demetilezést kezdeményezzen, először a DNS metilált CpG helyére kell toborozni . Két fehérjék látható toborozni TET enzimet egy metilezett citozin DNS vannak OGG1 (lásd az ábrát megindítása DNS demthylation) és Egr-1 .
OGG1
Az oxoguanin-glikoziláz ( OGG1 ) katalizálja az oxidatív módon sérült 8-OHdG bázis kimetszésének helyreállításának első lépését . Az OGG1 úgy talál 8-OHdG-t, hogy a lineáris DNS mentén csúszik 1000 bázispárnál 0,1 másodperc alatt. Az OGG1 nagyon gyorsan megtalálja a 8-OHdG-t. Az OGG1 fehérjék az oxidatív módon sérült DNS -hez kötődnek, maximum fél idő alatt, körülbelül 6 másodpercig. Amikor az OGG1 8-OHdG-t talál, megváltoztatja a konformációt és komplexet alkot a 8-OHdG-vel az OGG1 kötőzsebében. Az OGG1 nem azonnal lép fel a 8-OHdG eltávolítására. A 8-OHdG maximális felének eltávolítása körülbelül 30 percet vesz igénybe HeLa sejtekben in vitro , vagy körülbelül 11 percet a besugárzott egerek májában. A DNS-oxidáció a reaktív oxigénfajok által előnyösen guaninon megy végbe egy metilezett CpG-helyen, az 5-metil-citozinnal szomszédos guaninbázisok csökkent ionizációs potenciálja miatt. A TET1 a 8-OHdG-hez kötött OGG1-t köti (toboroztatja hozzá) (lásd az ábrát). Ez valószínűleg lehetővé teszi a TET1 számára, hogy demetilezzen egy szomszédos metilezett citozint. Amikor az emberi emlő epiteliális sejtek (MCF-10A) kezeltük H 2 O 2 , 8-OHdG nőtt a DNS-ben 3,5-szeres, és ez okozta a nagy léptékű demetilezés 5-metil-citozin és körülbelül 20% -a a kiindulási szint DNS.
EGR1
A gén korai növekedési válaszfehérje 1 ( EGR1 ) azonnali korai gén (IEG). Az IEG-k meghatározó jellemzője a fehérjeszintézistől független mRNS-szintjük gyors és átmeneti fel-szabályozása-perceken belül. Az EGR1 gyorsan indukálható neuronális aktivitással. Felnőttkorban az EGR1 széles körben expresszálódik az agyban, fenntartva az alapszintű expressziós szintet az agy több kulcsfontosságú területén, beleértve a mediális prefrontális kéreg, striatum, hippocampus és amygdala. Ez a kifejezés a megismerés, az érzelmi válasz, a társadalmi viselkedés és a jutalmazás érzékenységének ellenőrzéséhez kapcsolódik. Az EGR1 az 5′-GCGTGGGCG-3 'és az 5'-GCGGGGGCGG-3' motívumokkal kötődik a DNS-hez, és ezek a motívumok elsősorban a gének promoter régióiban fordulnak elő. A rövid izoforma TET1 -ek az agyban fejeződnek ki. Az EGR1 és a TET1 komplexet képez, amelyet mindkét fehérje C-terminális régiója közvetít, függetlenül a DNS-sel való társulástól. Az EGR1 TET1 -eket toboroz az EGR1 kötőhelyeket szegélyező genomi régiókba. EGR1 jelenlétében a TET1-ek képesek lokusz-specifikus demetilezésre és az EGR1 által szabályozott downstream gének expressziójának aktiválására.
A sejttenyésztési rendszerekben
Az átprogramozás mesterségesen is kiváltható exogén faktorok, általában transzkripciós faktorok bevezetésével . Ebben az összefüggésben gyakran utal indukált pluripotens őssejtek létrehozására érett sejtekből, például felnőtt fibroblasztokból . Ez lehetővé teszi a termelés őssejtek számára orvosbiológiai kutatások , mint például a kutatás őssejt terápia , használata nélkül embriók. Ezt úgy hajtják végre, hogy az őssejtekkel asszociált géneket érett sejtekbe transzfektálják vírusvektorok , például retrovírusok alkalmazásával .
Történelem
Az első személy, aki sikeresen demonstrálta az újraprogramozást, John Gurdon volt , aki 1962 -ben bebizonyította, hogy a differenciált szomatikus sejteket vissza lehet programozni embrionális állapotba, amikor sikerült úszó ebihalakat szereznie, miután a differenciált bélhámsejtek enukleált békatojásokba kerültek. Ezért az eredményért Shinya Yamanaka mellett 2012 -ben orvosi Nobel -díjat kapott . Yamanaka volt az első bizonyítani (2006-ban), hogy ez a szomatikus sejtek nukleáris transzfer vagy oocita-alapú átprogramozás folyamata (lásd alább), hogy Gurdon felfedezett, lehetne összefoglalt (egerekben) által meghatározott tényezők ( Oct4 , Sox2 , Klf4 , és c -Myc ) indukált pluripotens őssejtek (iPSC) előállításához. Más génkombinációkat is alkalmaztak.
Változékonyság
Az újraprogramozás után kapott sejtek tulajdonságai jelentősen változhatnak, különösen az iPSC -k között. A végtermékek átprogramozásának teljesítményében és funkcionális jellemzőiben mutatkozó eltérésekhez vezető tényezők közé tartozik a genetikai háttér, a szövetforrás, az átprogramozási faktor sztöchiometria és a sejttenyésztéssel kapcsolatos stresszorok.
Szomatikus sejtek nukleáris transzferje
A petesejt a szomatikus sejtek nukleáris transzferje után átprogramozhatja a felnőtt magot embrionális állapotba , így új szervezetet lehet kifejleszteni az ilyen sejtből.
Az újraprogramozás különbözik a szomatikus epitetípus kifejlődésétől , mivel a szomatikus epitetípusok potenciálisan megváltoztathatók, miután egy szervezet elhagyta az élet fejlődési szakaszát. A szomatikus sejtek nukleáris transzferje során az oocita kikapcsolja a szöveti specifikus géneket a szomatikus sejtmagban, és visszakapcsolja az embrionális specifikus géneket.
