Omprogrammering - Reprogramming
I biologi refererer omprogrammering til sletning og ombygning af epigenetiske mærker, såsom DNA -methylering , under pattedyrsudvikling eller i cellekultur. Sådan kontrol er også ofte forbundet med alternative kovalente ændringer af histoner .
Omprogrammeringer, der både er i stor skala (10% til 100% af epigenetiske mærker) og hurtige (timer til et par dage), forekommer på tre livsfaser af pattedyr. Næsten 100% af epigenetiske mærker omprogrammeres i to korte perioder tidligt i udviklingen efter befrugtning af et æg med en sæd . Derudover kan næsten 10% af DNA -methyleringerne i neuroner i hippocampus hurtigt ændres under dannelsen af en stærk frygthukommelse.
Efter befrugtning hos pattedyr slettes DNA-methyleringsmønstre stort set og derefter genetableres under tidlig embryonal udvikling. Næsten alle methyleringerne fra forældrene slettes, først under tidlig embryogenese og igen i gametogenese , idet demethylering og remethylering forekommer hver gang. Demethylering under tidlig embryogenese forekommer i præimplantationsperioden. Efter at en sæd befrugter et æg for at danne en zygote , sker hurtig DNA -demethylering af faderens DNA og langsommere demethylering af moder -DNA'et, indtil der dannes en morula, der næsten ikke har methylering. Efter blastocysten er dannet, kan methylering begynde, og med dannelsen af epiblasten finder der derefter en bølge af methylering sted, indtil embryoets implantationstadium. En anden periode med hurtig og næsten fuldstændig demethylering sker under gametogenese i de oprindelige kønsceller (PGC'er). Andre end PGC'erne, i postimplantationstrinnet, er methyleringsmønstre i somatiske celler fase- og vævsspecifikke med ændringer, der formodentlig definerer hver enkelt celletype og varer stabilt over lang tid.
Embryonisk udvikling
Musen sperm genomet er 80-90% methyleret ved dets CpG-steder i DNA, der beløber sig til ca. 20 millioner methylerede sites. Efter befrugtning demetyleres faderligt kromosom på seks timer ved en aktiv proces, inden DNA -replikation (blå linje i figur). I den modne oocyt methyleres ca. 40% af dets CpG -steder. Demethylering af moderens kromosom finder i vid udstrækning sted ved blokering af methylerende enzymer fra at virke på moder-oprindelses-DNA og ved fortynding af det methylerede moder-DNA under replikation (rød linje i figur). Den morula (ved 16 celletrinnet), har kun en lille mængde af DNA-methylering (sort linie i figur). Methylering begynder at stige 3,5 dage efter befrugtning i blastocysten , og en stor bølge af methylering sker derefter på dag 4,5 til 5,5 i epiblasten , der går fra 12% til 62% methylering og når maksimalt niveau efter implantation i livmoderen. Ved dag syv efter befrugtningen adskiller de nyligt dannede urkimceller (PGC) i det implanterede embryo sig fra de resterende somatiske celler . På dette tidspunkt har PGC'erne omtrent det samme methyleringsniveau som de somatiske celler.
De nydannede urkimceller (PGC) i det implanterede embryo afviger fra de somatiske celler. På dette tidspunkt har PGC'erne høje niveauer af methylering. Disse celler vandrer fra epiblasten mod gonadale højderyg . Nu formerer cellerne sig hurtigt og begynder demethylering i to bølger. I den første bølge er demethylering ved replikativ fortynding, men i den anden bølge er demethylering ved en aktiv proces. Den anden bølge fører til demethylering af specifikke loci. På dette tidspunkt viser PGC -genomerne de laveste niveauer af DNA -methylering af alle celler i hele livscyklussen [på embryonale dag 13.5 (E13.5), se den anden figur i dette afsnit].
Efter befrugtning migrerer nogle celler i det nydannede embryo til kønsryggen og vil i sidste ende blive kønsceller (sæd og oocytter) i den næste generation. På grund af fænomenet genomisk prægning er moder- og fadergener differentielt markerede og skal omprogrammeres korrekt hver gang de passerer gennem kimlinjen. Under gametogeneseprocessen skal de oprindelige kønsceller derfor have deres originale biparentale DNA-methyleringsmønstre slettet og genetableret baseret på den transmitterende forælders køn.
Efter befrugtning demetyleres fader- og modergener for at slette deres epigenetiske signaturer og erhverve totipotens. Der er asymmetri på dette tidspunkt: Den mandlige pronucleus gennemgår en hurtig og aktiv demethylering. I mellemtiden demetyleres den kvindelige pronucleus passivt under på hinanden følgende celledelinger. Processen med DNA-demethylering involverer reparation af basisk excision og sandsynligvis andre DNA-reparationsbaserede mekanismer. På trods af denne process globale karakter er der visse sekvenser, der undgår den, såsom differentielt methylerede regioner (DMRS) forbundet med præget gener, retrotransposoner og centromerisk heterochromatin . Remethylering er nødvendig igen for at differentiere embryoet til en komplet organisme.
In vitro- manipulation af præimplantationsembryoner har vist sig at forstyrre methyleringsmønstre på præget loci og spiller en afgørende rolle i klonede dyr.
Læring og hukommelse
Læring og hukommelse har permanensniveauer, der adskiller sig fra andre mentale processer som tanke, sprog og bevidsthed, som er midlertidige. Læring og hukommelse kan enten akkumuleres langsomt (multiplikationstabeller) eller hurtigt (røre ved en varm komfur), men når den er opnået, kan den genkaldes til bevidst brug i lang tid. Rotter, der udsættes for ét tilfælde af kontekstuel frygtkonditionering, skaber en særlig stærk langtidshukommelse. 24 timer efter træning viste det sig, at 9,17% af generne i rottegenomer af hippocampusneuroner var methyleret differentielt . Dette omfattede mere end 2.000 differentielt methylerede gener 24 timer efter træning, hvor over 500 gener blev demethyleret. Hippocampus -regionen i hjernen er, hvor kontekstuelle frygtminder først gemmes (se figur af hjernen, dette afsnit), men denne lagring er forbigående og forbliver ikke i hippocampus. Hos rotter afskaffes kontekstuel frygtkonditionering, når hippocampus udsættes for hippocampektomi kun 1 dag efter konditionering, men rotter bevarer en betydelig mængde kontekstuel frygt, når der pålægges en lang forsinkelse (28 dage) mellem tidspunktet for konditionering og tidspunktet for hippocampektomi.
Molekylære stadier
Tre molekylære faser er påkrævet til omprogrammering af DNA -methylomet . Fase 1: Rekruttering. De enzymer, der er nødvendige til omprogrammering, rekrutteres til genomsteder, der kræver demethylering eller methylering. Trin 2: Implementering. De indledende enzymatiske reaktioner finder sted. I tilfælde af methylering er dette et kort trin, der resulterer i methylering af cytosin til 5-methylcytosin. Trin 3: Base -excision DNA -reparation. Mellemprodukterne af demethylering katalyseres af specifikke enzymer i basis -excision -DNA -reparationsvejen, der endelig genopretter cystosin i DNA -sekvensen.
Figuren i dette afsnit angiver de centrale roller for ti-elleve translokationsmethylcytosindioxygenaser (TET'er) i demethyleringen af 5-methylcytosin til dannelse af cytosin. Som gennemgået i 2018 oxideres 5mC i første omgang meget ofte af TET-dioxygenaser for at generere 5-hydroxymethylcytosin (5hmC). I på hinanden følgende trin (se figur) hydroxylerer TET-enzymer yderligere 5hmC til dannelse af 5-formylcytosin (5fC) og 5-carboxylcytosin (5caC). Thymin-DNA glycosylase (TDG) genkender de mellemliggende baser 5fC og 5caC og fjerner den glycosidiske binding, hvilket resulterer i et apyrimidinisk sted (AP-sted). I en alternativ oxidativ deamineringsvej kan 5hmC oxidativt deamineres af APOBEC (AID/APOBEC) deaminaser til dannelse af 5-hydroxymethyluracil (5hmU) eller 5mC kan omdannes til thymin (Thy). 5hmU kan spaltes af TDG, SMUG1 , NEIL1 eller MBD4 . AP -steder og T: G -uoverensstemmelser repareres derefter ved hjælp af base excision -reparations (BER) enzymer til opnåelse af cytosin (Cyt).
TET familie
Isoformerne af TET -enzymerne omfatter mindst to isoformer af TET1, en af TET2 og tre isoformer af TET3. Den kanoniske TET1-isoform i fuld længde synes praktisk talt begrænset til tidlige embryoner, embryonale stamceller og urkimceller (PGC'er). Den dominerende TET1 -isoform i de fleste somatiske væv, i det mindste i musen, stammer fra alternativ promotorbrug, der giver anledning til et kort transkript og et afkortet protein betegnet TET1s. Isoformerne af TET3 er TET3FL i fuld længde, en TET3s med en lille splejsningsvariant og en form, der forekommer i oocytter og neuroner betegnet TET3o. TET3o er skabt ved alternativ promotorbrug og indeholder en ekstra første N-terminal exon, der koder for 11 aminosyrer. TET3o forekommer kun i oocytter og neuroner og blev ikke udtrykt i embryonale stamceller eller i nogen anden celletype eller testet voksen musevæv. Mens TET1-ekspression næppe kan påvises i oocytter og zygoter, og TET2 kun udtrykkes moderat, viser TET3-varianten TET3o ekstremt høje ekspressionsniveauer i oocytter og zygoter, men er næsten fraværende på 2-cellestadiet. Det er muligt, at TET3o, der er højt i neuroner, oocytter og zygoter på et cellestadium, er det vigtigste TET -enzym, der anvendes, når hurtige demethyleringer i meget stor skala forekommer i disse celler.
Rekruttering af TET til DNA
De TET enzymer ikke specifikt binder til 5-methylcytosin undtagen når rekrutteret. Uden rekruttering eller målretning binder TET1 overvejende til høje CG-promotorer og CpG-øer (CGI'er) genomomfattende af sit CXXC-domæne, der kan genkende ikke-methylerede CGI'er. TET2 har ikke en affinitet for 5-methylcytosin i DNA. CXXC-domænet for TET3 i fuld længde, som er den dominerende form udtrykt i neuroner, binder stærkest til CpG'er, hvor C blev omdannet til 5-carboxycytosin (5caC). Det binder imidlertid også til ikke-methylerede CpG'er .
For at et TET -enzym kan starte demethylering, skal det først rekrutteres til et methyleret CpG -sted i DNA. To af de proteiner, der viser sig at rekruttere et TET -enzym til et methyleret cytosin i DNA, er OGG1 (se figur Initiering af DNA -demthylering) og EGR1 .
OGG1
Oxoguaninglycosylase (OGG1) katalyserer det første trin i reparation af basisk excision af den oxidativt beskadigede base 8-OHdG . OGG1 finder 8-OHdG ved at glide langs det lineære DNA ved 1.000 basepar DNA på 0,1 sekunder. OGG1 finder meget hurtigt 8-OHdG. OGG1 -proteiner binder sig til oxidativt beskadiget DNA med en halv maksimal tid på ca. 6 sekunder. Når OGG1 finder 8-OHdG ændrer det konformation og komplekser med 8-OHdG i bindingslommen på OGG1. OGG1 handler ikke umiddelbart for at fjerne 8-OHdG. Halv maksimal fjernelse af 8-OHdG tager ca. 30 minutter i HeLa-celler in vitro eller ca. 11 minutter i leveren af bestrålede mus. DNA-oxidation af reaktive oxygenarter forekommer fortrinsvis ved en guanin i et methyleret CpG-sted på grund af et sænket ioniseringspotentiale for guaninbaser, der støder op til 5-methylcytosin. TET1 binder (rekrutteres til) OGG1 bundet til 8-OHdG (se figur). Dette tillader sandsynligvis TET1 at demethylere et tilstødende methyleret cytosin. Når humane brystepitelceller (MCF-10A) blev behandlet med H 2 O 2 , 8-OHdG steg i DNA med 3,5-fold, og dette medførte stor skala demethylering af 5-methylcytosin til ca. 20% af det oprindelige niveau i DNA.
EGR1
Genets early growth response protein 1 ( EGR1 ) er et øjeblikkeligt tidligt gen (IEG). Det afgørende kendetegn ved IEG'er er den hurtige og forbigående opregulering-inden for få minutter-af deres mRNA-niveauer uafhængigt af proteinsyntese. EGR1 kan hurtigt induceres af neuronal aktivitet. I voksenalderen udtrykkes EGR1 bredt i hele hjernen og opretholder baseline -ekspressionsniveauer i flere centrale områder i hjernen, herunder den mediale præfrontale cortex, striatum, hippocampus og amygdala. Dette udtryk er knyttet til kontrol af kognition, følelsesmæssig respons, social adfærd og følsomhed over for belønning. EGR1 binder til DNA på steder med motiverne 5'-GCGTGGGCG-3 'og 5'-GCGGGGGCGG-3', og disse motiver forekommer primært i promotorregioner af gener. De korte isoform TET1s udtrykkes i hjernen. EGR1 og TET1 danner et kompleks medieret af de C-terminale regioner i begge proteiner, uafhængigt af associering med DNA. EGR1 rekrutterer TET1'er til genomiske områder, der flankerer EGR1 -bindingssteder. I nærvær af EGR1 er TET1'er i stand til locuspecifik demethylering og aktivering af ekspressionen af nedstrøms gener reguleret af EGR1.
I cellekultursystemer
Omprogrammering kan også induceres kunstigt gennem introduktion af eksogene faktorer, sædvanligvis transkriptionsfaktorer . I denne sammenhæng refererer det ofte til dannelsen af inducerede pluripotente stamceller fra modne celler, såsom voksne fibroblaster . Dette tillader produktion af stamceller til biomedicinsk forskning , såsom forskning i stamcelleterapier , uden brug af embryoner. Det udføres ved transfektion af stamcelle-associerede gener til modne celler ved anvendelse af virale vektorer, såsom retrovira .
Historie
Den første person, der med succes demonstrerede omprogrammering, var John Gurdon , der i 1962 demonstrerede, at differentierede somatiske celler kunne omprogrammeres tilbage til en embryonisk tilstand, da det lykkedes ham at få svømmende haletudser efter overførslen af differentierede tarmepitelceller til enucleterede frøæg. For denne præstation modtog han Nobelprisen i medicin i 2012 sammen med Shinya Yamanaka . Yamanaka var den første til at vise (i 2006), at denne somatisk cellekerneoverførsel eller oocyt-baserede omprogrammering proces (se nedenfor), at Gurdon opdaget, kunne rekapituleres (i mus) ved definerede faktorer ( Oct4 , Sox2 , KLF4 , og c -Myc ) for at generere inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er). Andre kombinationer af gener er også blevet brugt.
Variabilitet
Egenskaberne for celler opnået efter omprogrammering kan variere betydeligt, især blandt iPSC'er. Faktorer, der fører til variation i udførelsen af omprogrammering og funktionelle træk ved slutprodukter, omfatter genetisk baggrund, vævskilde, omprogrammeringsfaktor støkiometri og stressorer relateret til cellekultur.
Somatisk celle atomoverførsel
En oocyt kan omprogrammere en voksen kerne til en embryonisk tilstand efter somatisk cellekerneoverførsel , så en ny organisme kan udvikles fra en sådan celle.
Omprogrammering adskiller sig fra udviklingen af en somatisk epitype , da somatiske epitypes potentielt kan ændres, efter at en organisme har forladt livets udviklingsstadium. Under somatisk cellekerneoverførsel slukker oocytten vævsspecifikke gener i den somatiske cellekerne og tænder embryonale specifikke gener tilbage.
