Riprogrammare - Reprogramming
In biologia, la riprogrammazione si riferisce alla cancellazione e al rimodellamento di segni epigenetici , come la metilazione del DNA , durante lo sviluppo dei mammiferi o nella coltura cellulare. Tale controllo è spesso associato anche a modificazioni covalenti alternative degli istoni .
Le riprogrammazioni su larga scala (dal 10% al 100% dei segni epigenetici) e rapide (da alcune ore a pochi giorni) si verificano in tre fasi della vita dei mammiferi. Quasi il 100% dei segni epigenetici viene riprogrammato in due brevi periodi all'inizio dello sviluppo dopo la fecondazione di un ovulo da parte di uno spermatozoo . Inoltre, quasi il 10% delle metilazioni del DNA nei neuroni dell'ippocampo può essere rapidamente alterato durante la formazione di un forte ricordo di paura.
Dopo la fecondazione nei mammiferi, i modelli di metilazione del DNA vengono in gran parte cancellati e quindi ristabiliti durante lo sviluppo embrionale iniziale. Quasi tutte le metilazioni dei genitori vengono cancellate, prima durante l' embriogenesi precoce e di nuovo nella gametogenesi , con demetilazione e rimetilazione che si verificano ogni volta. La demetilazione durante l'embriogenesi precoce si verifica nel periodo preimpianto. Dopo che uno spermatozoo feconda un ovulo per formare uno zigote , si verifica una rapida demetilazione del DNA del DNA paterno e una più lenta demetilazione del DNA materno fino alla formazione di una morula che non ha quasi metilazione. Dopo che la blastocisti si è formata, può iniziare la metilazione, e con la formazione dell'epiblasto ha luogo un'ondata di metilazione fino alla fase di impianto dell'embrione. Un altro periodo di demetilazione rapida e quasi completa si verifica durante la gametogenesi all'interno delle cellule germinali primordiali (PGC). Oltre ai PGC, nella fase post-impianto, i modelli di metilazione nelle cellule somatiche sono specifici per stadio e tessuto con cambiamenti che presumibilmente definiscono ogni singolo tipo di cellula e durano stabilmente a lungo.
Sviluppo embrionale
Il genoma dello sperma di topo è metilato per l' 80-90% nei suoi siti CpG nel DNA, pari a circa 20 milioni di siti metilati. Dopo la fecondazione , il cromosoma paterno è quasi completamente demetilato in sei ore da un processo attivo, prima della replicazione del DNA (linea blu in Figura). Nell'ovocita maturo , circa il 40% dei suoi siti CpG sono metilati. La demetilazione del cromosoma materno avviene in gran parte per blocco degli enzimi metilanti dall'agire sul DNA di origine materna e per diluizione del DNA materno metilato durante la replicazione (linea rossa in Figura). La morula (allo stadio di 16 cellule), ha solo una piccola quantità di metilazione del DNA (linea nera in Figura). La metilazione inizia ad aumentare a 3,5 giorni dopo la fecondazione nella blastocisti e poi una grande ondata di metilazione si verifica nei giorni 4,5-5,5 nell'epiblasto , passando dal 12% al 62% di metilazione e raggiungendo il livello massimo dopo l'impianto nell'utero. Entro il settimo giorno dopo la fecondazione, le cellule germinali primordiali appena formate (PGC) nell'embrione impiantato si segregano dalle restanti cellule somatiche . A questo punto le PGC hanno circa lo stesso livello di metilazione delle cellule somatiche.
Le cellule germinali primordiali appena formate (PGC) nell'embrione impiantato si devolgono dalle cellule somatiche. A questo punto i PGC hanno alti livelli di metilazione. Queste cellule migrano dall'epiblasto verso la cresta gonadica . Ora le cellule stanno rapidamente proliferando e iniziano la demetilazione in due ondate. Nella prima ondata, la demetilazione avviene per diluizione replicativa, ma nella seconda ondata la demetilazione avviene tramite un processo attivo. La seconda ondata porta alla demetilazione di loci specifici. A questo punto i genomi PGC mostrano i livelli più bassi di metilazione del DNA di qualsiasi cellula nell'intero ciclo di vita [al giorno embrionale 13.5 (E13.5), vedere la seconda figura in questa sezione].
Dopo la fecondazione, alcune cellule dell'embrione appena formato migrano verso la cresta germinale e alla fine diventeranno le cellule germinali (spermatozoo e ovociti) della generazione successiva. A causa del fenomeno dell'imprinting genomico , i genomi materni e paterni sono differenziati e devono essere opportunamente riprogrammati ogni volta che passano attraverso la linea germinale. Pertanto, durante il processo di gametogenesi le cellule germinali primordiali devono vedersi cancellare e ristabilire i loro schemi di metilazione del DNA biparentale originali in base al sesso del genitore trasmittente.
Dopo la fecondazione, i genomi paterno e materno vengono demetilati per cancellare le loro firme epigenetiche e acquisire totipotenza. C'è asimmetria a questo punto: il pronucleo maschile subisce una rapida e attiva demetilazione. Nel frattempo il pronucleo femminile viene demetilato passivamente durante le divisioni cellulari consecutive. Il processo di demetilazione del DNA coinvolge la riparazione per escissione della base e probabilmente altri meccanismi basati sulla riparazione del DNA. Nonostante la natura globale di questo processo, esistono alcune sequenze che lo evitano, come le regioni differenzialmente metilate (DMRS) associate a geni impressi, retrotrasposoni ed eterocromatina centromerica . La rimetilazione è di nuovo necessaria per differenziare l'embrione in un organismo completo.
È stato dimostrato che la manipolazione in vitro degli embrioni preimpianto interrompe i modelli di metilazione nei loci impressi e svolge un ruolo cruciale negli animali clonati.
Apprendimento e Memoria
L'apprendimento e la memoria hanno livelli di permanenza, diversi da altri processi mentali come il pensiero, il linguaggio e la coscienza, che sono di natura temporanea. L'apprendimento e la memoria possono essere accumulati lentamente (tavole di moltiplicazione) o rapidamente (toccando una stufa calda), ma una volta raggiunti, possono essere richiamati nell'uso consapevole per lungo tempo. I ratti sottoposti a un'istanza di condizionamento contestuale alla paura creano una memoria a lungo termine particolarmente forte. A 24 ore dopo l'allenamento, è stato riscontrato che il 9,17% dei geni nei genomi dei ratti dei neuroni dell'ippocampo erano differenzialmente metilati . Ciò includeva più di 2.000 geni differenzialmente metilati a 24 ore dopo l'allenamento, con oltre 500 geni demetilati. La regione dell'ippocampo del cervello è il luogo in cui vengono immagazzinati per la prima volta i ricordi di paura contestuali (vedi figura del cervello, questa sezione), ma questa memorizzazione è transitoria e non rimane nell'ippocampo. Nei ratti il condizionamento alla paura contestuale viene abolito quando l'ippocampo viene sottoposto a ippocampectomia appena 1 giorno dopo il condizionamento, ma i ratti conservano una notevole quantità di paura contestuale quando viene imposto un lungo ritardo (28 giorni) tra il momento del condizionamento e il momento dell'ippocampectomia.
Fasi molecolari
Sono necessari tre stadi molecolari per riprogrammare il metiloma del DNA . Fase 1: reclutamento. Gli enzimi necessari per la riprogrammazione vengono reclutati nei siti del genoma che richiedono demetilazione o metilazione. Fase 2: Attuazione. Avvengono le prime reazioni enzimatiche. Nel caso della metilazione, questo è un breve passaggio che porta alla metilazione della citosina a 5-metilcitosina. Fase 3: riparazione del DNA per escissione della base. I prodotti intermedi della demetilazione sono catalizzati da enzimi specifici della via di riparazione del DNA per escissione delle basi che infine ripristinano la cistosina nella sequenza del DNA.
La figura in questa sezione indica i ruoli centrali delle dieci undici traslocazioni metilcitosina diossigenasi (TET) nella demetilazione della 5-metilcitosina per formare la citosina. Come rivisto nel 2018, 5mC è molto spesso inizialmente ossidato dalle diossigenasi TET per generare 5-idrossimetilcitosina (5hmC). In fasi successive (vedi figura) gli enzimi TET idrossilano ulteriormente 5hmC per generare 5-formilcitosina (5fC) e 5-carbossilcitosina (5caC). Timina-DNA glicosilasi (TDG) riconosce le basi intermedie 5fC e 5caC ed asporta il legame glicosidico determinando un sito apirimidinico (sito AP). In una via ossidativa deaminazione alternativa, può essere 5hmC ossidativa deaminato da APOBEC (AID / APOBEC) deaminases in 5-hydroxymethyluracil (5hmU) o 5MC può essere convertito in timina (Thy). 5hmU può essere tagliato da TDG, SMUG1 , NEIL1 o MBD4 . I siti AP e i disallineamenti T:G vengono quindi riparati dagli enzimi di riparazione per escissione delle basi (BER) per produrre citosina (Cyt).
famiglia TET
Le isoforme degli enzimi TET includono almeno due isoforme di TET1, una di TET2 e tre isoforme di TET3. L'isoforma TET1 canonica integrale appare virtualmente limitata agli embrioni precoci, alle cellule staminali embrionali e alle cellule germinali primordiali (PGC). L'isoforma TET1 dominante nella maggior parte dei tessuti somatici, almeno nel topo, deriva dall'uso di promotori alternativi che danno origine a un breve trascritto ea una proteina troncata denominata TET1. Le isoforme di TET3 sono la forma a lunghezza intera TET3FL, una variante di giunzione a forma corta TET3 e una forma che si verifica negli ovociti e nei neuroni designati TET3o. TET3o è creato dall'uso di un promotore alternativo e contiene un primo esone N-terminale aggiuntivo che codifica per 11 amminoacidi. TET3o si verifica solo negli ovociti e nei neuroni e non è stato espresso nelle cellule staminali embrionali o in qualsiasi altro tipo di cellula o tessuto di topo adulto testato. Mentre l'espressione di TET1 può essere rilevata a malapena negli ovociti e negli zigoti e TET2 è espresso solo moderatamente, la variante di TET3 TET3o mostra livelli di espressione estremamente elevati negli ovociti e negli zigoti, ma è quasi assente allo stadio a 2 cellule. È possibile che TET3o, ricco di neuroni, ovociti e zigoti allo stadio di una cellula, sia il principale enzima TET utilizzato quando si verificano demetilazioni rapide su larga scala in queste cellule.
Reclutamento di TET al DNA
Gli enzimi TET non si legano specificamente alla 5-metilcitosina tranne quando vengono reclutati. Senza reclutamento o targeting, TET1 si lega prevalentemente ai promotori di CG elevati e alle isole CpG (CGI) in tutto il genoma tramite il suo dominio CXXC che può riconoscere CGI non metilati . TET2 non ha un'affinità per la 5-metilcitosina nel DNA. Il dominio CXXC del TET3 a lunghezza intera, che è la forma predominante espressa nei neuroni, si lega più fortemente ai CpG dove il C è stato convertito in 5-carbossicitosina (5caC). Tuttavia, si lega anche ai CpG non metilati .
Affinché un enzima TET possa iniziare la demetilazione, deve prima essere reclutato in un sito CpG metilato nel DNA. Due delle proteine mostrate per reclutare un enzima TET in una citosina metilata nel DNA sono OGG1 (vedi figura Inizio della demtilazione del DNA) ed EGR1 .
OGG1
L'ossoguanina glicosilasi (OGG1) catalizza il primo passo nella riparazione per escissione della base della base 8-OHdG danneggiata ossidativamente . OGG1 trova 8-OHdG scorrendo lungo il DNA lineare a 1.000 paia di basi di DNA in 0,1 secondi. OGG1 trova molto rapidamente 8-OHdG. Le proteine OGG1 si legano al DNA danneggiato ossidativamente con un tempo massimo dimezzato di circa 6 secondi. Quando OGG1 trova 8-OHdG cambia conformazione e si complessa con 8-OHdG nella tasca di legame di OGG1. OGG1 non agisce immediatamente per rimuovere l'8-OHdG. La rimozione massima della metà dell'8-OHdG richiede circa 30 minuti nelle cellule HeLa in vitro , o circa 11 minuti nel fegato dei topi irradiati. L'ossidazione del DNA da parte di specie reattive dell'ossigeno avviene preferibilmente in corrispondenza di una guanina in un sito CpG metilato, a causa di un potenziale di ionizzazione ridotto delle basi della guanina adiacenti alla 5-metilcitosina. TET1 si lega (viene reclutato a) l'OGG1 legato a 8-OHdG (vedi figura). Ciò probabilmente consente a TET1 di demetilare una citosina metilata adiacente. Quando le cellule epiteliali mammarie umane (MCF-10A) sono state trattate con H 2 O 2 , l'8-OHdG è aumentato nel DNA di 3,5 volte e ciò ha causato una demetilazione su larga scala della 5-metilcitosina a circa il 20% del suo livello iniziale nel DNA.
EGR1
La proteina 1 della risposta di crescita precoce del gene ( EGR1 ) è un gene precoce immediato (IEG). La caratteristica distintiva degli IEG è la rapida e transitoria up-regulation, in pochi minuti, dei loro livelli di mRNA indipendentemente dalla sintesi proteica. EGR1 può essere rapidamente indotto dall'attività neuronale. Nell'età adulta, EGR1 è espresso ampiamente in tutto il cervello, mantenendo i livelli di espressione di base in diverse aree chiave del cervello, tra cui la corteccia prefrontale mediale, lo striato, l'ippocampo e l'amigdala. Questa espressione è legata al controllo della cognizione, alla risposta emotiva, al comportamento sociale e alla sensibilità alla ricompensa. EGR1 si lega al DNA nei siti con i motivi 5′-GCTGGGGGCG-3′ e 5'-GCGGGGGCGG-3′ e questi motivi si verificano principalmente nelle regioni promotrici dei geni. L'isoforma corta TET1s è espressa nel cervello. EGR1 e TET1 formano un complesso mediato dalle regioni C-terminali di entrambe le proteine, indipendentemente dall'associazione con il DNA. EGR1 recluta TET1 nelle regioni genomiche che fiancheggiano i siti di legame di EGR1. In presenza di EGR1, TET1s è in grado di demetilazione locus-specific e attivazione dell'espressione di geni a valle regolati da EGR1.
Nei sistemi di coltura cellulare
La riprogrammazione può essere indotta anche artificialmente attraverso l'introduzione di fattori esogeni, solitamente fattori di trascrizione . In questo contesto si fa spesso riferimento alla creazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule mature come i fibroblasti adulti . Ciò consente la produzione di cellule staminali per la ricerca biomedica , come la ricerca sulle terapie con cellule staminali , senza l'utilizzo di embrioni. Viene effettuato mediante la trasfezione di geni associati alle cellule staminali in cellule mature utilizzando vettori virali come i retrovirus .
Storia
La prima persona a dimostrare con successo la riprogrammazione fu John Gurdon , che nel 1962 dimostrò che le cellule somatiche differenziate potevano essere riprogrammate in uno stato embrionale quando riuscì a ottenere girini nuotatori in seguito al trasferimento di cellule epiteliali intestinali differenziate in uova di rana enucleate. Per questo traguardo ha ricevuto nel 2012 il Premio Nobel per la Medicina al fianco di Shinya Yamanaka . Yamanaka è stato il primo a dimostrare (nel 2006) che questo trasferimento nucleare di cellule somatiche o processo di riprogrammazione basato sugli ovociti (vedi sotto), che Gurdon ha scoperto, potrebbe essere ricapitolato (nei topi) da fattori definiti ( Oct4 , Sox2 , Klf4 e c -Myc ) per generare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Sono state utilizzate anche altre combinazioni di geni.
Variabilità
Le proprietà delle cellule ottenute dopo la riprogrammazione possono variare in modo significativo, in particolare tra le iPSC. I fattori che portano alla variazione delle prestazioni della riprogrammazione e delle caratteristiche funzionali dei prodotti finali includono il background genetico, la fonte tissutale, la stechiometria del fattore di riprogrammazione e i fattori di stress legati alla coltura cellulare.
Trasferimento nucleare di cellule somatiche
Un ovocita può riprogrammare un nucleo adulto in uno stato embrionale dopo il trasferimento nucleare di cellule somatiche , in modo che un nuovo organismo possa essere sviluppato da tale cellula.
La riprogrammazione è distinta dallo sviluppo di un epitipo somatico , poiché gli epitipi somatici possono essere potenzialmente alterati dopo che un organismo ha lasciato lo stadio di sviluppo della vita. Durante il trasferimento nucleare delle cellule somatiche, l'ovocita disattiva i geni specifici del tessuto nel nucleo della cellula somatica e si riaccende sui geni specifici dell'embrione.
