Přeprogramování - Reprogramming
V biologii se přeprogramování týká vymazání a přestavby epigenetických značek, jako je methylace DNA , během vývoje savců nebo v buněčné kultuře. Taková kontrola je také často spojena s alternativními kovalentními modifikacemi histonů .
Přeprogramování, která jsou jak rozsáhlá (10% až 100% epigenetických značek), tak rychlá (hodiny až několik dní), se vyskytují ve třech fázích života savců. Téměř 100% epigenetických značek jsou přeprogramovat na dvě krátká období počátku ve vývoji po oplodnění po dosažení vajíčka pomocí spermií . Kromě toho lze téměř 10% methylací DNA v neuronech hippocampu rychle změnit během vytváření silné paměti strachu.
Po oplodnění u savců jsou vzorce methylace DNA do značné míry vymazány a poté obnoveny během raného embryonálního vývoje. Téměř všechny methylace od rodičů jsou vymazány, nejprve během rané embryogeneze a znovu v gametogenezi , přičemž pokaždé dochází k demetylaci a remetylaci. Demetylace během rané embryogeneze probíhá v preimplantačním období. Poté, co sperma oplodní vajíčko za vzniku zygoty , nastává rychlá demetylace DNA otcovské DNA a pomalejší demetylace mateřské DNA, dokud se nevytvoří morula, která nemá téměř žádnou methylaci. Po vytvoření blastocysty může začít methylace a s tvorbou epiblastu pak probíhá vlna methylace až do implantační fáze embrya. Další období rychlé a téměř úplné demetylace nastává během gametogeneze v prvotních zárodečných buňkách (PGC). Jiné než PGC, v postimplantační fázi, jsou methylační vzorce v somatických buňkách specifické pro jednotlivé fáze a tkáně se změnami, které pravděpodobně definují každý jednotlivý typ buňky a vydrží stabilně po dlouhou dobu.
Embryonální vývoj
Genom myšího spermatu je v místech CpG v DNA methylován z 80–90% , což představuje asi 20 milionů methylovaných míst. Po oplodnění je otcovský chromozom během šesti hodin aktivním procesem před replikací DNA téměř úplně demetylován (modrá čára na obrázku). Ve zralém oocytu je asi 40% jeho CpG míst metylováno. Demetylace mateřského chromozomu do značné míry probíhá blokováním methylačních enzymů z působení na DNA mateřského původu a ředěním methylované mateřské DNA během replikace (červená čára na obrázku). Morula (ve stadiu 16 buněk), má jen malé množství DNA methylace (černá čára na obrázku). Methylace se začíná zvyšovat 3,5 dne po oplodnění v blastocysty a velká vlna methylace pak nastává ve dnech 4,5 až 5,5 v epiblastu , přechází z 12% na 62% methylace a dosahuje maximální úrovně po implantaci v děloze. Sedmý den po oplodnění se nově vytvořené primordiální zárodečné buňky (PGC) v implantovaném embryu oddělí od zbývajících somatických buněk . V tomto okamžiku mají PGC přibližně stejnou úroveň methylace jako somatické buňky.
Nově vytvořené primordiální zárodečné buňky (PGC) v implantovaném embryu pocházejí ze somatických buněk. V tomto okamžiku mají PGC vysokou úroveň methylace. Tyto buňky migrují z epiblastu směrem ke gonadálnímu hřbetu . Buňky nyní rychle proliferují a začínají demetylovat ve dvou vlnách. V první vlně je demetylace replikačním ředěním, ale ve druhé vlně je demetylace aktivním procesem. Druhá vlna vede k demetylaci konkrétních lokusů. V tomto okamžiku genomy PGC vykazují nejnižší úrovně methylace DNA ze všech buněk v celém životním cyklu [v embryonálním dni 13,5 (E13,5), viz druhý obrázek v této části].
Po oplodnění některé buňky nově vytvořeného embrya migrují do zárodečného hřbetu a nakonec se stanou zárodečnými buňkami (spermatem a oocyty) příští generace. Vzhledem k fenoménu genomového otisku jsou mateřské a otcovské genomy odlišně označeny a musí být řádně přeprogramovány při každém průchodu zárodečnou linií. Proto během procesu gametogeneze musí být u prvotních zárodečných buněk vymazány a obnoveny původní biparentální methylační vzorce DNA na základě pohlaví přenášejícího rodiče.
Po oplodnění jsou otcovské a mateřské genomy demetylovány, aby se vymazaly jejich epigenetické podpisy a získala totipotence. V tomto bodě existuje asymetrie: mužský pronukleus prochází rychlou a aktivní demetylací. Mezitím je ženský pronukleus pasivně demetylován během postupného dělení buněk. Proces demetylace DNA zahrnuje opravu excize bází a pravděpodobně další mechanismy založené na opravách DNA. Navzdory globální povaze tohoto procesu existují určité sekvence, které se tomu vyhýbají, jako jsou různě methylované oblasti (DMRS) spojené s potištěnými geny, retrotranspozony a centromerickým heterochromatinem . K diferenciaci embrya na kompletní organismus je opět nutná remetylace.
Ukázalo se, že manipulace s preimplantačními embryi in vitro narušuje methylační vzorce v potištěných lokusech a hraje zásadní roli u klonovaných zvířat.
Učení a paměť
Učení a paměť mají úrovně trvalosti, lišící se od jiných mentálních procesů, jako je myšlení, jazyk a vědomí, které mají dočasný charakter. Učení a paměť lze buď akumulovat pomalu (multiplikační tabulky), nebo rychle (dotýkat se horkých kamen), ale jakmile je získáno, lze je na dlouhou dobu vrátit k vědomému používání. Krysy vystavené jedné instanci kontextového podmiňování strachu vytvářejí obzvláště silnou dlouhodobou paměť. 24 hodin po tréninku bylo 9,17% genů v krysích genomech hippocampusových neuronů odlišně methylovaných . To zahrnovalo více než 2 000 různě methylovaných genů 24 hodin po tréninku, přičemž více než 500 genů bylo demetylováno. Hippocampusová oblast mozku je místem, kde se nejprve ukládají kontextové vzpomínky na strach (viz obrázek mozku, tato část), ale toto úložiště je přechodné a nezůstává v hippocampu. U potkanů je kontextové podmiňování strachu zrušeno, když je hippocampus podroben hippocampektomii pouhý 1 den po kondicionování, ale krysy si zachovávají značné množství kontextového strachu, když je mezi dobou kondicionování a dobou hippocampektomie uloženo dlouhé zpoždění (28 dní).
Molekulární stadia
K přeprogramování methylomu DNA jsou zapotřebí tři molekulární stupně . Fáze 1: Nábor. Enzymy potřebné k přeprogramování se rekrutují do genomových míst, která vyžadují demetylaci nebo methylaci. Fáze 2: Implementace. Probíhají počáteční enzymatické reakce. V případě methylace jde o krátký krok, jehož výsledkem je methylace cytosinu na 5-methylcytosin. Fáze 3: Oprava DNA s vyříznutím základny. Meziprodukty demetylace jsou katalyzovány specifickými enzymy opravné cesty DNA pro excizi bází, které nakonec obnoví cystosin v sekvenci DNA.
Obrázek v této části ukazuje ústřední úlohu deseti jedenácti translokačních methylcytosin dioxygenáz (TET) při demetylaci 5-methylcytosinu za vzniku cytosinu. Jak bylo uvedeno v roce 2018, 5 mC je velmi často zpočátku oxidováno TET dioxygenázami za vzniku 5-hydroxymethylcytosinu (5 hmC). V postupných krocích (viz obrázek) TET enzymy dále hydroxylují 5hmC za vzniku 5-formylcytosinu (5fC) a 5-karboxylcytosinu (5caC). Glykosyláza thymin-DNA (TDG) rozpoznává meziproduktové báze 5fC a 5caC a vyřízne glykosidickou vazbu, což vede k apyrimidinovému místu (AP místo). V alternativní oxidační deaminační cestě lze 5hmC oxidačně deaminovat pomocí APOBEC (AID/APOBEC) deamináz za vzniku 5-hydroxymethyluracilu (5hmU) nebo 5mC lze převést na thymin (Thy). 5hmU lze štěpit pomocí TDG, SMUG1 , NEIL1 nebo MBD4 . Místa AP a nesoulad T: G se poté opraví enzymy BER (base excision repair) za získání cytosinu (Cyt).
TET rodina
Izoformy těchto enzymů Tet obsahují alespoň dvě izoformy TET1, jeden z TET2 a tři izoformy TET3. Kanonická izoforma TET1 v plné délce se zdá být prakticky omezena na raná embrya, embryonální kmenové buňky a primordiální zárodečné buňky (PGC). Dominantní izoforma TET1 ve většině somatických tkání, alespoň u myší, pochází z alternativního použití promotoru, které vede ke vzniku krátkého transkriptu a zkráceného proteinu označeného TET1. Izoformy TET3 jsou úplná forma TET3FL, krátká forma sestřihové varianty TET3s a forma, která se vyskytuje v oocytech a neuronech označovaných TET3o. TET3o je vytvořen alternativním použitím promotoru a obsahuje další první N-koncový exon kódující 11 aminokyselin. TET3o se vyskytuje pouze v oocytech a neuronech a nebyl exprimován v embryonálních kmenových buňkách ani v žádném jiném testovaném buněčném typu nebo dospělé myší tkáni. Zatímco expresi TET1 lze v oocytech a zygotech detekovat jen stěží a TET2 je exprimován pouze mírně, varianta TET3 TET3o vykazuje extrémně vysoké úrovně exprese v oocytech a zygotech, ale ve stadiu 2 buněk téměř chybí. Je možné, že TET3o s vysokým obsahem neuronů, oocytů a zygotů v jednom buněčném stadiu je hlavním TET enzymem, který se používá v případě, že se v těchto buňkách vyskytují rychlé demetylace ve velkém měřítku.
Nábor TET na DNA
Tyto TET enzymy nejsou specificky vážou na 5-methylcytosin výjimkou přijetí. Bez náboru nebo cílení, TET1 převážně váže k vysokým promotory CG a CpG ostrovů (CGI) celého genomu podle svém CXXC domény, které mohou rozpoznat un-methylovaný CGI. TET2 nemá afinitu k 5-methylcytosinu v DNA. CXXC doména úplného TET3, která je převládající formou exprimovanou v neuronech, se nejsilněji váže na CpG, kde C bylo převedeno na 5-karboxycytosin (5caC). Váže se však také na nemetylované CpG .
Aby mohl TET enzym zahájit demetylaci, musí být nejprve rekrutován do methylovaného CpG místa v DNA. Dva z proteinů, u nichž bylo ukázáno, že získávají enzym TET na methylovaný cytosin v DNA, jsou OGG1 (viz obrázek Zahájení demylace DNA) a EGR1 .
OGG1
Oxoguaninglykosyláza (OGG1) katalyzuje první krok opravy excize báze oxidačně poškozené báze 8-OHdG . OGG1 najde 8-OHdG klouzáním po lineární DNA na 1000 párů bází DNA za 0,1 sekundy. OGG1 velmi rychle najde 8-OHdG. Proteiny OGG1 se vážou na oxidačně poškozenou DNA s polovičním maximálním časem asi 6 sekund. Když OGG1 najde 8-OHdG, změní konformaci a vytvoří komplexy s 8-OHdG ve vazebné kapse OGG1. OGG1 nejedná okamžitě k odstranění 8-OHdG. Poloviční maximální odstranění 8-OHdG trvá asi 30 minut v HeLa buňkách in vitro , nebo asi 11 minut v játrech ozářených myší. Oxidace DNA reaktivními druhy kyslíku se přednostně vyskytuje na guaninu v methylovaném CpG místě, kvůli sníženému ionizačnímu potenciálu guaninových bází sousedících s 5-methylcytosinem. TET1 se váže (je přijímán do) OGG1 vázaného na 8-OHdG (viz obrázek). To pravděpodobně umožňuje TET1 demetylovat sousední methylovaný cytosin. Když byly lidské epitelové buňky mléčné žlázy (MCF-10A), zpracuje s H 2 O 2 , 8-OHdG zvýšil v DNA o 3,5-násobek, a to způsobilo velkém měřítku demethylace 5-methylcytosinu až asi 20% původní úrovně v DNA.
EGR1
Gen 1 pro včasnou růstovou reakci genu ( EGR1 ) je bezprostřední časný gen (IEG). Definující charakteristikou IEG je rychlá a přechodná up-regulace-během několika minut-jejich hladin mRNA nezávisle na syntéze proteinů. EGR1 může být rychle indukován neuronální aktivitou. V dospělosti je EGR1 exprimován široce v celém mozku, přičemž udržuje základní úrovně exprese v několika klíčových oblastech mozku, včetně mediálního prefrontálního kortexu, striata, hippocampu a amygdaly. Tento výraz je spojen s kontrolou poznávání, emoční reakce, sociálního chování a citlivosti na odměnu. EGR1 se váže na DNA v místech s motivy 5'-GCGTGGGCG-3 'a 5'-GCGGGGGCGG-3' a tyto motivy se vyskytují primárně v promotorových oblastech genů. Krátká izoforma TET1 je exprimována v mozku. EGR1 a TET1 tvoří komplex zprostředkovaný C-koncovými oblastmi obou proteinů, nezávisle na asociaci s DNA. EGR1 rekrutuje TET1 do genomových oblastí lemujících vazebná místa EGR1. V přítomnosti EGR1 jsou TET1 schopné lokusově specifické demetylace a aktivace exprese downstream genů regulovaných EGR1.
V systémech buněčných kultur
Přeprogramování lze také vyvolat uměle zavedením exogenních faktorů, obvykle transkripčních faktorů . V této souvislosti se často odkazuje na tvorbu indukovaných pluripotentních kmenových buněk ze zralých buněk, jako jsou dospělé fibroblasty . To umožňuje produkci kmenových buněk pro biomedicínský výzkum , jako je výzkum terapií kmenovými buňkami , bez použití embryí. Provádí se transfekcí genů asociovaných s kmenovými buňkami do zralých buněk pomocí virových vektorů, jako jsou retroviry .
Dějiny
Prvním člověkem, který úspěšně předvedl přeprogramování, byl John Gurdon , který v roce 1962 prokázal, že diferencované somatické buňky lze přeprogramovat zpět do embryonálního stavu, když se mu po získání diferencovaných střevních epiteliálních buněk do enukleovaných žabích vajíček podařilo získat pulující pulce. Za tento úspěch získal Nobelovu cenu za medicínu 2012 po boku Shinya Yamanaka . Yamanaka jako první demonstroval (v roce 2006), že tento proces jaderného přenosu somatických buněk nebo proces přeprogramování na bázi oocytů (viz níže), který Gurdon objevil, by mohl být rekapitulován (u myší) definovanými faktory ( Oct4 , Sox2 , Klf4 a c -Myc ) ke generování indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC). Byly také použity jiné kombinace genů.
Variabilita
Vlastnosti buněk získaných po přeprogramování se mohou výrazně lišit, zejména mezi iPSC. Faktory vedoucí ke změnám ve výkonu přeprogramování a funkčních vlastností konečných produktů zahrnují genetické pozadí, zdroj tkáně, stechiometrii reprogramovacího faktoru a stresory související s buněčnou kulturou.
Jaderný přenos somatických buněk
Oocytů může přeprogramovat dospělého jádro do embryonálního stavu po přenosu jader somatických buněk , tak, aby nový organismus může být vyvinut z takové buňky.
Přeprogramování se liší od vývoje somatického epitypu , protože somatické epitypy lze potenciálně změnit poté, co organismus opustil vývojovou fázi života. Během jaderného přenosu somatických buněk oocyt vypíná tkáňově specifické geny v jádru somatických buněk a vrací se zpět k embryonálně specifickým genům.
