P-element - P element

P-elementer er transponerbare elementer som ble oppdaget i Drosophila som årsaksmidler til genetiske egenskaper som kalles hybrid dysgenese . Transposonet er ansvarlig for P-trekk ved P-elementet, og det finnes bare i ville fluer.

Alle P-elementer har en kanonisk struktur som inneholder 31 bp terminal inverterte gjentakelser og 11 bp interne inverterte gjentakelser lokalisert ved THAP-domenet til transposasen . De kortere og lengste P-elementene er ikke-økonomiske elementer. De lengste P- elementene koder for transposase som er nødvendig for transponering. Ved hybrid dysgenese forårsaker en stamme av Drosophila par med en annen stamme av Drosophila som produserer hybrid avkom kromosomskade kjent å være dysgen. Hybrid dysgenese krever et bidrag fra begge foreldrene. For eksempel, i PM-systemet, P-belastning som bidrar til mor og M-belastning som bidrar til mors. Det motsatte korset, med M far og P mor, produserer normalt avkom, ettersom det krysser P x P eller M x M måte. P-mannlig kromosom kan forårsake dysgenese når du krysses med en M-kvinne.

P-elementet koder også for en undertrykkelse av transponering, som akkumuleres i cytoplasma under utvikling av celler. Således, i et kryss av en P- eller M-hann med en P-hunn, inneholder den kvinnelige cytoplasma undertrykkeren, som binder seg til alle P-elementer og forhindrer deres transponering.

P-elementer brukes ofte som mutagene midler i genetiske eksperimenter med Drosophila. En fordel med denne tilnærmingen er at mutasjonene er enkle å finne.

P-elementet koder for proteinet P-transposase og flankeres av terminale inverterte gjentakelser som er viktige for dets mobilitet. I motsetning til kvinner i laboratoriestamme, er kvinner av vill type antatt å uttrykke en hemmer for P-transposasefunksjon. Denne hemmeren reduserer forstyrrelsen i genomet forårsaket av P-elementene, og tillater fruktbar avkom. Bevis for dette kommer fra kryss av kvinnelige laboratorier (som mangler P transposasehemmer ) med menn av vill type (som har P-elementer). I mangel av hemmer, kan P-elementene spre seg i hele genomet, forstyrre mange gener og drepe avkom.

Kjennetegn

P-elementet er et klass II transposon , og beveger seg av en DNA-basert "klipp og lim" -mekanisme. Sekvensen omfatter 4 eksoner med 3 introner . Fullstendig spleising av intronene produserer transposase-enzymet, mens alternativ delvis spleising av intron 1 og 2 og bare i intron 3 koder P-elementets repressor. Den komplette, autonomt element P koder en transposase enzym , som gjenkjenner 31 bp terminale inverterte gjentagelser av P-element og katalyserer P element fjerning og gjeninnsetting. Det komplette elementet er 2907 bp; ikke-autonome P-elementer inneholder en intern sletting av varierende lengde som avskaffer transposase-produksjon, men slike elementer kan fortsatt mobiliseres hvis transposase kodes andre steder i genomet . P-elementinnsetting og påfølgende eksisjon resulterer i produksjon av 8 bp direkte repetisjoner, og tilstedeværelsen av slike repetisjoner er en indikasjon på tidligere P-elementaktivitet.

Hybrid dysgenese

Hybriddysgenese refererer til den høye mutasjonshastigheten i kimlinjeceller i Drosophila- stammer som er et resultat av et kryss av hanner med autonome P-elementer (P Strain / P cytotype) og kvinner som mangler P-elementer (M Strain / M cytotype). Hybriddysgenesesyndromet er preget av temperaturavhengig sterilitet, forhøyede mutasjonshastigheter og økt omlegging av kromosom og rekombinasjon.

Fenotypen med hybrid dysgenese påvirkes av transponering av P-elementer i kjønnscellecellene til avkom av P- stammehanner med M-stamme- hunner. Transposisjon skjer bare i kim-linjeceller, fordi en spleisningshendelse som er nødvendig for å lage transposase mRNA ikke forekommer i somatiske celler.

Hybrid dysgenese manifesterer seg når man krysser P-stammehanner med M-belastningskvinner og ikke når man krysser P-stammehunn (hunner med autonome P-elementer) med M-stammehanner. Eggene til P-stamme hunnene inneholder store mengder repressorprotein som forhindrer transkripsjon av transposasegenet. Eggene fra M-stamme mødre, som ikke inneholder repressorproteinet, muliggjør transponering av P-elementer fra fedres sæd. Hos P-stamme kvinner er repressorene funnet i cytoplasma. Derfor, når P-stamme hanner befruktninger M-stamme-hunner (hvis cytoplasma ikke inneholder noen repressor), bidrar hannen sitt genom med P-elementet, men ikke den mannlige cytoplasma som fører til P-stammeavkom.

Denne effekten bidrar til at piRNA bare arves i mors linje, noe som gir en forsvarsmekanisme mot P-elementer.

Bruk i molekylærbiologi

P-elementet har funnet bred bruk i Drosophila- forskning som mutagen. Mutagenesis-systemet bruker typisk et autonomt, men immobile element, og et mobilt ikke-autonomt element. Fluer fra påfølgende generasjoner kan deretter screenes ved hjelp av fenotype eller PCR .

Naturlig forekommende P-elementer inneholder:

  • Kodingssekvens for enzymet transposase
  • Gjenkjenningssekvenser for transposasehandling

Transposase er et enzym som regulerer og katalyserer eksisjonen av et P-element fra verts-DNAet, kutter på to gjenkjennelsessteder og deretter setter inn tilfeldig igjen. Det er tilfeldig innsetting som kan forstyrre eksisterende gener, eller bære et tilleggsgen, som kan brukes til genetisk forskning.

For å bruke dette som et nyttig og kontrollerbart genetisk verktøy, må de to delene av P-elementet skilles for å forhindre ukontrollert transponering. De normale genetiske verktøyene er derfor:

  • DNA-koding for transposase uten transposase-gjenkjennelsessekvenser, slik at den ikke kan sette inn.
  • En "P Plasmid"

P Plasmider inneholder alltid:

  • Et Drosophila- reportergen, ofte en rødøye-markør (produktet av det hvite genet).
  • Transposase gjenkjenningssekvenser.

Og kan inneholde:

Metoder for bruk

Det er to hovedmåter å bruke disse verktøyene på:

Fly transformasjon

  1. Klon P-elementet til et plasmid og transformer og vokser dette i bakterier.
  2. Fjern P-transposasen og erstatt den med genet av interesse.
  3. Mikroinjiser den bakre enden av et tidlig stadium (pre-cellularisering) embryo med DNA som koder for transposase og et plasmid med reportergenet, gen av interesse og transposase anerkjennelsessekvenser.
  4. Tilfeldig transponering skjer ved å sette inn genet av interesse og reportergen.
  5. Når genet av interesse er satt inn, er det ikke lenger mobilt fordi det ikke kan produsere sin egen P-transposase.
  6. Dyr fluer og krysse for å fjerne genetisk variasjon mellom cellene i organismen. (Bare noen av cellene i organismen vil ha blitt transformert. Forhåpentligvis ender noen av disse transformerte cellene i kimlinjen. Et transformert gamet vil gi opphav til en organisme uten variasjon mellom cellene).
  7. Se etter fluer som uttrykker reportergenet. Disse bærer det innsatte genet av interesse, så kan undersøkes for å bestemme fenotypen på grunn av genet av interesse.

Det innsatte genet kan ha skadet funksjonen til et av vertsgenene. Flere linjer med fluer er påkrevd slik at sammenligning kan finne sted og sikre at ingen ekstra gener er blitt slått ut.

Insertional mutagenese

  1. Mikroinjiser embryoet med DNA som koder for transposase og et plasmid med reportergenet og transposase-gjenkjennelsessekvensene (og ofte E. coli- reportergenet og replikasjonsstart osv.).
  2. Tilfeldig transponering skjer, og innfører reportergenet tilfeldig. Innsettingen har en tendens til å skje i nærheten av aktivt transkriberte gener, da det er her kromatinstrukturen er løsest, slik at DNAet er mest tilgjengelig.
  3. Dyr fluer og kryss for å fjerne genetisk variasjon mellom cellene i organismen (se over).
  4. Se etter fluer som uttrykker reportergenet. Disse har opplevd en vellykket transponering, så kan undersøkes for å bestemme fenotypen på grunn av mutasjon av eksisterende gener.

Mulige mutasjoner:

  1. Innføring i et oversatt område => hybridprotein / avkortet protein. Forårsaker vanligvis tap av proteinfunksjon, selv om mer komplekse effekter sees.
  2. Innlegging i et intron => endret spleisemønster / spleisefeil. Vanligvis resulterer i proteinavkortning eller produksjon av inaktive feil-skjøte produkter, selv om mer komplekse effekter er vanlige.
  3. Innføring i 5 '(sekvensen som blir mRNA 5' UTR) utranslateret region => avkortning av transkript. Resultat resulterer vanligvis i at mRNA ikke inneholder en 5 'hette , noe som fører til mindre effektiv oversettelse.
  4. Innsetting i promoter => reduksjon / fullstendig tap av uttrykk. Alltid resulterer i sterkt reduserte proteinproduksjonsnivåer. Den mest nyttige typen innsetting for analyse på grunn av enkelhetens situasjon.
  5. Innlegging mellom promotor og oppstrøms enhancers => tap av enhancer-funksjon / kapring av enhancer-funksjon for reportergen. † Reduserer generelt nivået av proteinspesifisitet til celletype, selv om komplekse effekter ofte sees.
Forbedrer fangst
Hovedartikkel: Enhancer trap

Kapring av en forsterker fra et annet gen tillater analyse av funksjonen til den forsterkeren. Dette, spesielt hvis reportergenet er for et lysstoffrør, kan brukes til å kartlegge uttrykk av det muterte genet gjennom organismen, og er et veldig kraftig verktøy. Det er et nyttig verktøy for å se på genuttrykksmønstre (midlertidig og romlig).

Annen bruk

Disse metodene blir referert til som omvendt genetikk. Omvendt genetikk er en tilnærming til å oppdage funksjonen til et gen ved å analysere de fenotypiske effektene av spesifikke gensekvenser oppnådd ved DNA-sekvensering

Analyse av mutageneseprodukter

Når funksjonen til det muterte proteinet er bestemt, er det mulig å sekvensere / rense / klone områdene som flankerer innsatsen ved følgende metoder:

Invers PCR

Image
Prosess for analyse av DNA som flankerer et kjent innlegg ved PCR.
Hovedartikkel: Inverse PCR
  1. Isoler fluen genomet.
  2. Gjennomgå en lett fordøyelse (ved bruk av et enzym [enzym 1] som kjent IKKE er å kutte i reportergenet), og gi fragmenter på noen få kilobaser, noen få med innsetting og dets flankerende DNA.
  3. Selvligerer fordøyelsen (lav DNA-konsentrasjon for å sikre selvligering) og gir et utvalg av sirkulære DNA-fragmenter, noen få med innsetting og dets flankerende DNA.
  4. Skjær plasmidene på et tidspunkt i reportergenet (med et enzym [enzym 2] som er kjent for å kutte veldig sjelden i genomisk DNA, men det er kjent i reportergenet).
  5. Ved å bruke primere for reportergeneseksjonene kan DNA amplifiseres for sekvensering .

Prosessen med kutting, selvligering og gjenskjæring tillater amplifisering av flankerende regioner av DNA uten å kjenne til sekvensen. Punktet der ligeringen skjedde kan sees ved å identifisere det kuttede stedet til [enzym 1].

Plasmidredning

Image
Prosess for analyse av DNA som flankerer et kjent innlegg ved hjelp av plasmidredning.
  1. Isoler fluen genomet.
  2. Gjennomgå en lett fordøyelse (ved å bruke et enzym [enzym 1] som er kjent for å kutte i grensen mellom reportergenet og E. coli reportergenet og plasmidsekvensene), noe som gir fragmenter på noen få kilobaser, noen få med E. coli reporteren, plasmidsekvensene og dets flankerende DNA.
  3. Selvligerer fordøyelsen (lav DNA-konsentrasjon for å sikre selvligering) og gir et utvalg av sirkulære DNA-fragmenter, noen få med E. coli- reporteren, plasmidsekvensene og dens flankerende DNA.
  4. Sett plasmidene inn i E. coli- celler (f.eks. Ved elektroporering).
  5. Velg plasmider for det selekterbare markørgenet E. coli . Bare vellykkede innsatser av plasmider med plasmidets "husholdning" -sekvenser vil uttrykke dette genet.
  6. Genet kan klones for videre analyse.

referanser

  • Leland Hartwell et al .. 2004. Genetics - From Genes to Genomes 2nd Edition. McGraw-Hill
  • Engels, WR P Elements in Drosophila

Eksterne linker