Mikroinjeksjon - Microinjection
Mikroinjeksjon er bruk av en glassmikropipette for å injisere et flytende stoff på et mikroskopisk eller grense makroskopisk nivå. Målet er ofte en levende celle, men kan også omfatte intercellular space. Mikroinjeksjon er en enkel mekanisk prosess som vanligvis involverer et invertert mikroskop med en forstørrelseseffekt på rundt 200 ganger (selv om det noen ganger utføres ved hjelp av et dissekere stereomikroskop ved 40-50x eller et tradisjonelt sammensatt oppreist mikroskop med samme effekt som en invertert modell).
For prosesser som cellulær eller pronuklear injeksjon er målcellen plassert under mikroskopet og to mikromanipulatorer - en som holder pipetten og en som holder en mikrokapillær nål, vanligvis mellom 0,5 og 5 µm i diameter (større hvis man injiserer stamceller i et embryo) - er brukes til å trenge gjennom cellemembranen og / eller kjernekonvolutten . På denne måten kan prosessen brukes til å introdusere en vektor i en enkelt celle. Mikroinjeksjon kan også bli brukt i kloning av organismer, i studier av cellebiologi og virus, og for behandling av mannlig subfertility gjennom intracytoplasmatisk spermieinjeksjon (ICSI, / ɪ k s i / IK -se ).
Historie
Bruken av mikroinjeksjon som en biologisk prosedyre begynte på begynnelsen av det tjuende århundre, selv om den ikke ble brukt ofte gjennom 1970-tallet. På 1990-tallet hadde bruken eskalert betydelig, og det regnes nå som en vanlig laboratorieteknikk, sammen med vesikelfusjon , elektroporering , kjemisk transfeksjon og viraltransduksjon , for å introdusere en liten mengde av et stoff i et lite mål.
Grunnleggende typer
Det er to grunnleggende typer mikroinjeksjonssystemer. Det første kalles et konstant strømningssystem og det andre kalles et pulserende strømningssystem . I et system med konstant strømning, som er relativt enkelt og billig, men klønete og utdatert, leveres en konstant strøm av en prøve fra en mikropipette, og mengden av prøven som injiseres bestemmes av hvor lenge nålen blir igjen i cellen. Dette systemet krever vanligvis en regulert trykkilde, en kapillærholder, og enten en grov eller en fin mikromanipulator. Et pulserende strømningssystem tillater imidlertid større kontroll og konsistens over mengden injisert prøve: den vanligste ordningen for intracytoplasmatisk sædinjeksjon inkluderer en Eppendorf "Femtojet" -injektor kombinert med en Eppendorf "InjectMan", selv om prosedyrer som involverer andre mål vanligvis tar fordelen med mye billigere utstyr med lignende kapasitet. På grunn av den økte kontrollen over nålplassering og bevegelse, og i tillegg til den økte presisjonen over volumet av stoffet som leveres, resulterer den pulserende flytteknikken vanligvis i mindre skade på den mottakende cellen enn teknikken med konstant flyt. Imidlertid har Eppendorf-linjen i det minste et komplekst brukergrensesnitt, og dens spesifikke systemkomponenter er vanligvis mye dyrere enn de som er nødvendige for å skape et konstant strømningssystem eller andre pulsede strømningsinjeksjonssystemer.
Pronukleær injeksjon
Pronukleær injeksjon er en teknikk som brukes til å skape transgene organismer ved å injisere genetisk materiale i kjernen til en befruktet oocytt . Denne teknikken brukes ofte til å studere rollen til gener ved bruk av musedyrmodeller.
Pronukleær injeksjon hos mus
Den pronukleære injeksjonen av musesæd er en av de to vanligste metodene for å produsere transgene dyr (sammen med genteknologi for embryonale stamceller ). For at pronukleær injeksjon skal lykkes, må det genetiske materialet (typisk lineært DNA ) injiseres mens det genetiske materialet fra oocytt og sæd er separat (dvs. den pronukleære fasen ). For å oppnå disse oocyttene, blir mus ofte superovulert ved bruk av gonadotrofiner . Når plugging har skjedd, høstes oocytter fra musen og injiseres med genetisk materiale. Oocytten implanteres deretter i eggledningen til et pseudogravid dyr . Mens effektiviteten varierer, kan 10-40% av mus født fra disse implanterte oocyttene inneholde den injiserte konstruksjonen . Transgene mus kan deretter avles for å skape transgene linjer.
