P prvek - P element

P prvky jsou transponovatelné prvky, které byly objeveny v Drosophile jako původci genetických vlastností zvaných hybridní dysgeneze . Transpozon je zodpovědný za P vlastnost prvku P a nachází se pouze u divokých mušek.

Všechny P prvky mají kanonickou strukturu obsahující 31 bp terminálních invertovaných repetic a 11 bp interních invertovaných repetic umístěných v THAP doméně transposázy . Kratší a nejdelší prvky P jsou neautonomní prvky. Nejdelší P prvky kódují transpozázu potřebnou pro transpozici. V hybridní dysgenezi se jeden kmen Drosophila páří s jiným kmenem Drosophila produkujícím hybridní potomky, což způsobuje chromozomální poškození, o kterém je známo, že je dysgenické. Hybridní dysgeneze vyžaduje příspěvek obou rodičů. Například v systému PM kmen P přispívající otcovsky a kmen M přispívající matce. Reverzní kříž, s M otcem a P matkou, produkuje normální potomky, protože kříží způsobem P x P nebo M x M. Mužský chromozom P může způsobit křížení s M ženou dysgenezi.

P prvek také kóduje supresor transpozice, který se hromadí v cytoplazmě během vývoje buněk. Takže při křížení P nebo M samce s P samicí obsahuje cytoplazma samice supresor, který se váže na jakékoli P prvky a brání jejich transpozici.

P prvky se běžně používají jako mutagenní látky v genetických experimentech s Drosophila. Jednou z výhod tohoto přístupu je, že mutace lze snadno lokalizovat.

Prvek P kóduje transpozázu proteinu P a je ohraničen terminálními invertovanými opakováními, které jsou důležité pro jeho mobilitu. Na rozdíl od samic laboratorního kmene se předpokládá, že samice divokého typu exprimují inhibitor funkce P transpozázy. Tento inhibitor snižuje narušení genomu způsobené prvky P a umožňuje plodné potomstvo. Důkazy o tom pocházejí z křížení laboratorních žen (které postrádají inhibitor P transpozázy ) s muži divokého typu (které mají P prvky). Při absenci inhibitoru mohou prvky P proliferovat v celém genomu, narušovat mnoho genů a zabíjet potomstvo.

Vlastnosti

Prvek P je transpozonem třídy II a pohybuje se mechanismem „vyjímání a vkládání“ založeným na DNA. Sekvence obsahuje 4 exony se 3 introny . Kompletní sestřih intronů produkuje transposázový enzym, zatímco alternativní částečné sestřih intronu 1 a 2 ponechávající pouze intron 3 kóduje represor P prvku. Kompletní, autonomní P prvek kóduje transposázový enzym , který rozpoznává 31bp koncové invertované opakování P prvku a katalyzuje excizi a opětovné vložení P prvku. Kompletní prvek je 2907 bp; neautonomní P prvky obsahují vnitřní deleci různé délky, která ruší produkci transposázy, ale tyto prvky lze stále mobilizovat, pokud je transposáza kódována jinde v genomu . Vložení P elementu a následná excize vede k produkci 8 bp přímých opakování a přítomnost takových opakování je indikátorem předchozí aktivity P elementu.

Hybridní dysgeneze

Hybridní dysgeneze označuje vysokou míru mutace v buňkách zárodečné linie kmenů Drosophila, která je výsledkem křížení mužů s autonomními P prvky (P kmen / P cytotyp) a žen, které postrádají P prvky (M kmen / M cytotyp). Syndrom hybridní dysgeneze se vyznačuje sterilitou závislou na teplotě, zvýšenými rychlostmi mutací a zvýšeným přeskupením a rekombinací chromozomů.

Fenotyp hybridní dysgeneze je ovlivněn transpozicí P prvků v zárodečných buňkách potomků mužů kmene P u žen kmene M. K transpozici dochází pouze v buňkách zárodečných linií, protože k sestřihové události potřebné k vytvoření transpozázové mRNA nedochází v somatických buňkách.

Hybridní dysgeneze se projevuje při křížení samců kmene P se samicemi kmene M a nikoli při křížení samic kmene P (samice s autonomními prvky P) s muži kmene M. Vejce samic kmene P obsahují vysoké množství represorového proteinu, který zabraňuje transkripci genu pro transpozázu. Vajíčka matek kmene M, která neobsahují represorový protein, umožňují transpozici prvků P ze spermií otců. U samic kmene P se represory nacházejí v cytoplazmě. Když tedy samci kmene P oplodňují samice kmene M (jejichž cytoplazma neobsahuje žádný represor), samec přispívá svým genomem k prvku P, ale nikoli samčí cytoplazma vedoucí k potomkům kmene P.

Tento efekt přispívá k tomu, že se piRNA dědí pouze v mateřské linii, což poskytuje obranný mechanismus proti P prvkům.

Využití v molekulární biologii

Prvek P našel ve výzkumu Drosophila široké využití jako mutagen. Systém mutageneze obvykle používá autonomní, ale nepohyblivý prvek a mobilní neautonomní prvek. Mouchy z následujících generací pak mohou být skrínovány fenotypem nebo PCR .

Přirozeně se vyskytující prvky P obsahují:

• Kódující sekvence pro enzym transposázu
• Sekvence rozpoznávání pro akci transpozázy

Transposáza je enzym, který reguluje a katalyzuje excizi prvku P z DNA hostitele, stříhá na dvou rozpoznávacích místech a poté náhodně znovu vloží. Pro genetický výzkum lze použít náhodnou inzerci, která může interferovat s existujícími geny nebo nést další gen.

Chcete-li to použít jako užitečný a kontrolovatelný genetický nástroj, je třeba oddělit dvě části prvku P, aby se zabránilo nekontrolované transpozici. Normální genetické nástroje jsou tedy:

• DNA kódující transposázu bez sekvencí rozpoznávajících transposázu, takže ji nelze vložit.
• "P plazmid"

P Plazmidy vždy obsahují:

• Drosophila reporterový gen, často červených očí značka (produkt z bílého genu).
• Sekvence rozpoznávání transposázy.

A může obsahovat:

• Zajímavý gen
• E. coli selektovatelného markerového genu, často nějaké rezistence vůči antibiotikům .
• Počátek replikace a další související sekvence plazmového „úklidu“.

Způsoby použití

Existují dva hlavní způsoby, jak tyto nástroje využít:

Fly transformace

1. Klonujte prvek P do plazmidu a transformujte jej a pěstujte v bakteriích.
2. Odstraňte transpozázu P a nahraďte ji požadovaným genem.
3. Mikroinjektujte zadní konec embrya v raném stadiu ( předcelulární polarizací ) s DNA kódující transposázu a plazmid s reportérovým genem, sledovaným genem a sekvencemi rozpoznávajícími transpozázu.
4. Nastává náhodná transpozice vložením požadovaného genu a reportérového genu.
5. Jakmile je požadovaný gen vložen, již není mobilní, protože nemůže produkovat vlastní P transpozázu.
6. Pěstujte mouchy a křížte se, abyste odstranili genetickou variabilitu mezi buňkami organismu. (Transformovány budou pouze některé buňky organismu. Doufejme, že některé z těchto transformovaných buněk skončí v zárodečné linii. Transformovaná gameta způsobí vznik organismu bez variací mezi jeho buňkami).
7. Hledejte mouchy exprimující reportérovy geny. Ty nesou vložený požadovaný gen, takže je lze zkoumat, aby se určil fenotyp způsobený požadovaným genem.

Vložený gen mohl poškodit funkci jednoho z hostitelských genů. Je zapotřebí několik linií mouch, aby mohlo dojít k porovnání a zajistit, aby nebyly vyřazeny žádné další geny.

Inzerční mutageneze

1. Mikroinjekci embrya pomocí DNA kódující transposázu a plazmidu s reportérovým genem a rozpoznávacími sekvencemi transpozázy (a často reportérovým genem E. coli a počátkem replikace atd.).
2. Dochází k náhodné transpozici a náhodnému vložení reportérového genu. Inzerce má tendenci se vyskytovat v blízkosti aktivně transkribovaných genů, protože právě tam je struktura chromatinu nejvolnější, takže DNA je nejdostupnější.
3. Pěstujte mouchy a křížte se, abyste odstranili genetickou variabilitu mezi buňkami organismu (viz výše).
4. Hledejte mouchy exprimující reportérovy geny. U nich došlo k úspěšné transpozici, takže je lze zkoumat za účelem stanovení fenotypu v důsledku mutace existujících genů.

Možné mutace:

1. Vložení do přeložené oblasti => hybridní protein / zkrácený protein. Obvykle způsobuje ztrátu funkce bílkovin, i když se projevují složitější účinky.
2. Vložení do intronu => pozměněný spojovací vzor / selhání spojování. Obvykle vede ke zkrácení proteinu nebo k produkci neaktivních nesprávně sestřižených produktů, i když složitější účinky jsou běžné.
3. Vložení do 5 '(sekvence, která se stane mRNA 5' UTR) nepřekládanou oblastí => zkrácení transkriptu. Obvykle vede k selhání, že mRNA obsahuje 5 'čepičku , což vede k méně efektivní translaci.
4. Vložení do promotoru => redukce / úplná ztráta výrazu. Vždy vede k výrazně snížené úrovni produkce bílkovin. Nejužitečnější typ vložení pro analýzu z důvodu jednoduchosti situace.
5. Vložení mezi promotor a upstream zesilovače => ztráta funkce zesilovače / únos funkce zesilovače pro reportérový gen. † Obecně snižuje hladinu specificity proteinu k buněčnému typu, i když jsou často vidět komplexní účinky.

Vylepšení zachycení

Únos zesilovače z jiného genu umožňuje analýzu funkce tohoto zesilovače. To, zvláště pokud je reportérový gen pro fluorescenční protein, lze použít k mapování exprese mutovaného genu v organismu a je to velmi mocný nástroj. Je to užitečný nástroj pro sledování vzorů genové exprese (časově a prostorově).

Jiné použití

Tyto metody se označují jako reverzní genetika. Reverzní genetika je přístup k objevení funkce genu analýzou fenotypových účinků specifických genových sekvencí získaných sekvenováním DNA

Analýza produktů mutageneze

Jakmile je určena funkce mutovaného proteinu, je možné sekvenovat / purifikovat / klonovat oblasti lemující inzerci následujícími způsoby:

Inverzní PCR

Proces analýzy DNA lemující známý inzert pomocí PCR.

1. Izolovat genom mouchy.
2. Podstoupit lehký digest (s použitím enzymu [enzym 1], o kterém je známo, že se neštěpí v reportérovém genu), čímž získáte fragmenty několika kilobází, několik s inzercí a její lemující DNA.
3. Vlastní ligace digesce (nízká koncentrace DNA, aby se zajistila vlastní ligace), čímž se získá výběr kruhových fragmentů DNA, několik s vložením a jeho lemující DNA.
4. Řez plasmidy v určitém okamžiku reportérového genu (enzymem [enzym 2], o kterém je známo, že štěpí velmi vzácně v genomové DNA, ale je známo, že se jedná o reportérský gen).
5. Použitím primerů pro sekce reportérového genu může být DNA amplifikována pro sekvenování .

Proces štěpení, vlastní ligace a opětného štěpení umožňuje amplifikaci okrajových oblastí DNA bez znalosti sekvence. Bod, ve kterém došlo k ligaci, lze zjistit identifikováním místa řezu [enzym 1].

Záchrana plazmidu

Proces analýzy DNA lemující známý inzert záchranou plazmidu.

1. Izolovat genom mouchy.
2. Podstoupit lehký digest (pomocí enzymu [enzym 1], o kterém je známo, že štěpí na hranici mezi reportérovým genem a reportérovým genem E. coli a plazmidovými sekvencemi), čímž vzniknou fragmenty několika kilobází, několik s reportérem E. coli , plasmidové sekvence a její lemující DNA.
3. Vlastní ligace digesce (nízká koncentrace DNA, aby se zajistila vlastní ligace), čímž se získá výběr kruhových fragmentů DNA, několik s reportérem E. coli , plazmidovými sekvencemi a jeho lemující DNA.
4. Vložte plasmidy do buněk E. coli (např. Elektroporací).
5. Vyberte plazmidy pro gen selekčního markeru E. coli . Tento gen exprimují pouze úspěšné inzerty plazmidů se sekvencemi „úklidové“ plazmidu.
6. Gen může být klonován pro další analýzu.

Reference

• Leland Hartwell et al .. 2004. Genetics - From Genes to Genomes 2nd Edition. McGraw-Hill
• Engels, prvky WR P v Drosophile

externí odkazy

• FlyBase