Microarray

Microarray är en samlingsbeteckning för moderna molekylärbiologiska undersökningssystem som tillåter parallellanalys av flera tusen enskilda föremål i en liten mängd biologiskt provmaterial. Det finns olika former av mikroarrayer, som ibland också kallas "genchips" eller " biochips " eftersom de, som ett datachip, kan innehålla mycket information i ett mycket litet utrymme.

Cdnaarray.jpg

DNA-mikroarrays

En DNA-mikromatris skrivs ut av en robot.

DNA-mikroarrays används i genomanalys , diagnostik och i undersökningar av differentiell genuttryck . DNA-mikroarrayer används för att detektera mängden mRNA och ncRNA för vissa gener eller rRNA för vissa organismer. Det finns huvudsakligen två olika typer av DNA-mikroarrays, å ena sidan de där cDNA , oligonukleotider eller fragment av PCR-produkter motsvarande mRNA och ncRNA är tryckta på bärarmaterialet ("fläckiga mikroarrays") och de i vilka syntetiskt tillverkade oligonukleotider är baserade ("oligonukleotidmikroarrayer"). Dessa fungerar som sonder som är kopplade till definierade positioner på ett rutnät, för. B. appliceras på glasbärare.

  • Den NAPPA , engelska för nukleinsyra programmerbar proteinarray , används för snabb produktion av proteiner. För detta ändamål skrivs DNA ut i hög densitet på matriser och sedan nedsänkt i en reaktionsbuffert. Proteiner som bildas fångas sedan upp av ankare, så kallade halo-tag ligander . Denna process kallas HaloTag-NAPPA. Det utvecklades av ordföranden för systembiologi av växter vid TUM tillsammans med forskare från USA och Japan och publicerades i juni 2016.

Protein mikroarrays

Det protein -Microarray såväl som en DNA-mikromatris innefattar ett flertal testfält i trånga utrymmen. Men med proteinmikroarrayen fixeras små mängder protein på bärarmaterialet i varje testfält - även känd som en fläck. Den process som kallas gäckande kräver en hög grad av precision på grund av de små provytor på en kort sträcka och därför utförs av särskilda anordningar.

Antingen kan ett renat protein, till exempel en antikropp, eller en proteinblandning av det testade provet nu appliceras på matrisen. De platser där ingen interaktion äger rum förblir tomma efter att ett tvättsteg har genomförts. Detektionsmetoden gör det möjligt att skilja mellan fläckar med och utan protein-protein-interaktion. Kvantitativa detektionsmetoder är också möjliga där mängden vidhäftande protein kan bestämmas.

Typer av proteinmikroarrays

Image
Microarrays

De olika typerna av proteinmikroarrayer kan differentieras beroende på typen av interaktion ( antigen - antikropp , enzymsubstrat , receptor- protein eller allmän protein-protein-interaktion). Det kan också differentieras om proteinerna i provet fixeras i matrisen och sedan testas med ett stort antal specifika, kända testproteiner - eller om testproteinerna fixeras i testområdena och sedan tar reaktionen med provproteinerna plats.

  • Den omvänd fas proteinmikroarray -metoden (även kallad lysat microarray) används för att detektera antigener i cellysat av olika vävnader eller i proteinfraktioner erhållna genom isoelektrisk fokusering . Celllysatet eller proteinfraktionen upptäcks på bärarmaterialet i mikroarrayen, varefter antikroppen appliceras. Antikroppen fäster vid varje testfält med antikropp-antigen-interaktion. Fält med antikroppar kan sedan detekteras som med Western blot . Detta görs vanligtvis med en märkt andra antikropp som binder den antigenspecifika första antikroppen. Denna andra antikropp kopplas sedan med ett fluorescerande eller nära infrarött färgämne och detekteras med en lämplig skanner, eller kopplas med ett enzym, pepparrotsperoxidas, vilket möjliggör en ljusemitterande reaktion eller en färgreaktion (användning av kromogener) för syfte med upptäckt. Lysatmikroarrays möjliggör detektion och kvantifiering av ett antigen i många olika lysat samtidigt. Denna metod begränsas endast av det begränsade antalet specifika antikroppar som krävs för exakt detektion av ett specifikt antigen.
  • Antikroppsmikroarrayer : Antikropparna fixeras (prickas) och sedan appliceras provet (t.ex. komplexa celllysat) på matrisen. Antigenet binder till respektive immobiliserade antikropp (så kallad infångningsantikropp). Dessa fångade antigener måste nu detekteras med en andra specifik antikropp (detektionsantikropp), som sedan antingen märks i sig själv eller detekteras med en märkt andra antikropp. Detta komplex detekteras och kvantifieras sedan med hjälp av etiketten (se ELISA ).
  • Antigenmikroarrayer : Ett annat antigen fixeras på varje testområde i matrisen. Om serumet i ett blodprov innehåller motsvarande specifik antikropp, kommer det att hålla sig till testområdet. Detta gör att reaktionen på ett stort antal bakterieantigener eller allergener kan testas samtidigt. Den första antikroppen är bunden av en märkt andra antikropp i ett ytterligare inkubationssteg och kan detekteras.
  • I proteindomän-mikroarrayer fixeras fusionsproteiner på matrisen för att detektera protein-protein-interaktioner. Fusionsproteinet möjliggör tillförlitlig fixering på matrisen med den första delen utan att den andra proteindelens förmåga att interagera störs. Det applicerade proteinet håller sig bara till de testområden där det finns en interaktion.
  • En peptidmikroarray innehåller korta peptidsekvenser som, beroende på metod, antingen syntetiseras in situ eller appliceras direkt på ytan med användning av en laserskrivare och fastfassyntes . Denna metod har flera fördelar, inklusive: lägre synteskostnader och ett större antal peptider som kan skrivas ut parallellt. Peptidmikroarrays används bland annat. används för profilering av enzymer , för undersökning av antikroppsepitoper ( epitopmapping ) eller för att identifiera de aminosyror som är nödvändiga för proteinbindning. I praktiken är peptidmikroarrays bland annat. Används för att övervaka terapeutiska ingrepp, stratifiera patienter, profilera immunsvar hos enskilda patienter när sjukdomen fortskrider, eller för att utveckla diagnostiska och terapeutiska medel och vaccinationer .

En möjlig fördel jämfört med DNA-mikroarrayer är snabbare analys på plats av prover, eftersom den ofta nödvändiga amplifieringen av genetiskt material och hybridisering kan undvikas. Proteinmikroarrays tillåter också analys med hög genomströmning av proteinnivån. Den senaste forskningen tyder på att mRNA- och proteinnivåer inte alltid korrelerar med varandra. Således indikerar cDNA-mikroarrayresultat inte nödvändigtvis proteinuttryck.

Transfektionsmikroarrays

Detta är en teknik där DNA appliceras på arrayen tillsammans med ett transfektionsreagens (alternativt kan arrayen behandlas med transfektionsreagenset efter spotting). Olika cellinjer kan odlas på en grupp som framställts på detta sätt (se cellodling ), som, beroende på var på matrisen de fäster vid ytan, transfekteras med respektive gen. På detta sätt kan många gener undersökas parallellt med avseende på förhållandet mellan gen och fenotyp i en hög genomströmningsprocess. Detta kommer troligen att minska klyftan mellan genomforskning och medicinsk diagnostik i framtiden.

Vävnadsmikroarrays

Med vävnadsmikroarrays (TMA) monteras stansade vävnadscylindrar av olika ursprung på ett paraffinblock. Beroende på stansens storlek, vanligtvis mellan 0,6 mm och 2 mm i diameter, kan mellan 50 och 400 prover rymmas på ett område på 1,5 x 3 cm och samtidigt t.ex. B. undersökas med hjälp av immunhistologi . Med denna metod kan till exempel många prover (t.ex. tumörer av olika ursprung) undersökas på en bild med bara en enda applicering av en antikropp. Fördelen här är låg materialförbrukning och samtidigt ett stort antal erhållna dataposter. Det kan vara nackdeligt att den utstansade vävnadssektionen inte är representativ för hela vävnaden. Denna nackdel uppstår dock vanligtvis bara i så kallade komplexa vävnader (t.ex. lever). I den vanliga applikationen med tumörmaterial kan detta problem försummas, eftersom det vid tillämpningen av TMA inte är det enskilda resultatet som är viktigt, utan resultaten av den kollektiva undersökningen. Förutom användning inom immunhistologi är analyser med användning av in situ-hybridisering också möjliga (FISH, CISH).

Kolhydrater mikroarrays

Sockermolekyler kan nu också detekteras med hjälp av microarray-teknik.

historia

Microarray-teknik uppstod inte förrän på 1990-talet . På grund av det höga antalet tester per tidsenhet, den relativt lilla mängden prover och den lätthet med vilken den kan automatiseras, har den snabbt etablerat sig som en viktig komponent inom forskning inom farmaci , medicin , biokemi , bioteknik , genetik och molekylärbiologi .

Innan dess gel- baserade elektrofores eller kromatografiska har metoder som används i dessa forskningsområden för samma uppgift , som var mycket mer tidskrävande. En tidigare metod är dot blot- analysen.

För proteinmikroarrays beskrev Ekins i slutet av 1980 - talet att "mikrofläckanalyser" är extremt känsliga för detektion. Liknande tillvägagångssätt har redan beskrivits för produktion av antikropps-makroarrayer. År 2000 möjliggjorde enhetsutvecklingen för genomforskning produktion av proteinmikroarrays med många tusen DNA-sonder på ett mycket litet område.

Se även

litteratur

  • Hans-Joachim Müller, Thomas Röder: Experimentören: mikroarrayer . Spectrum Academic Publishing House, Heidelberg 2004, ISBN 3-8274-1438-5 .
  • Carolyn R Cho, Mark Labow, Mischa Reinhardt, Jan van Oostrum, Manuel Peitsch: Tillämpningen av systembiologi för läkemedelsutveckling. I: Aktuellt yttrande inom kemisk biologi. 10, 2006, s. 294-302.
  • J. Packeisen, E. Korsching, H. Herbst, W. Boecker, H. Buerger: Avmystifierad ... vävnadsmikroarray-teknik. I: Mol Pathol. 56 (4), 2003 aug, s. 198-204.
  • JH Malone, B. Oliver: Microarrays, djup sekvensering och det verkliga måttet på transkriptomen. I: BMC Biology. 9, 2011, s. 34. (Recension) doi: 10.1186 / 1741-7007-9-34

webb-länkar

Individuella bevis

  1. ↑ HaloTag-NAPPA TU-München
  2. ↑ HaloTag-NAPPA-publikation
  3. ↑ Volker Stadler, Thomas Felgenhauer, Mario Beyer, Simon Fernandez, Klaus Leibe: Combinatorial Synthesis of Peptide Arrays with a Laser Printer . I: Angewandte Chemie International Edition . tejp 47 , nr. 37 , 1 september 2008, ISSN  1521-3773 , s. 7132-7135 , doi : 10.1002 / anie.200801616 .
  4. Bre Frank Breitling, Thomas Felgenhauer, Alexander Nesterov, Volker Lindenstruth, Volker Stadler: Particle-Based Synthesis of Peptide Arrays . I: ChemBioChem . tejp 10 , nr. 5 , 23 mars 2009, ISSN  1439-7633 , s. 803-808 , doi : 10.1002 / cbic.200800735 .