Microarray

A Microarray a modern molekuláris biológiai vizsgálati rendszerek gyűjtőfogalma, amely lehetővé teszi több ezer egyedi elem párhuzamos elemzését kis mennyiségű biológiai mintaanyagban. Különböző formájú mikro-sugarak vannak, amelyeket néha „ génforgácsnak ” vagy „ biochipnek ” is neveznek, mert a számítógépes chiphez hasonlóan nagyon kis információt tartalmazhatnak nagyon kis helyen.

DNS mikro-sugarak

Médiafájl lejátszása

A DNS mikroarray-t robot nyomtatja.

A DNS mikrosávokat a genom elemzésében , a diagnosztikában és a differenciális génexpresszió vizsgálatában használják . DNS-mikro-sugarakat használnak bizonyos gének mRNS- és ncRNS- mennyiségének vagy bizonyos organizmusok rRNS- jének kimutatására. Főként két különböző típusú DNS-mikro-sáv létezik, egyrészt azok, amelyekben az mRNS-nek és az ncRNS-nek megfelelő cDNS , oligonukleotidok vagy PCR-termékek fragmensei vannak nyomtatva a hordozóanyagra ("foltos mikro-sugarak"), és azok, amelyekben szintetikusan gyártott oligonukleotidok alapulnak ("oligonukleotid mikrorayák"). Ezek szondákként szolgálnak, amelyek a rács meghatározott pozícióihoz kapcsolódnak. B. üveghordozókra kell alkalmazni.

• A NAPPA , angolul a nukleinsavval programozható fehérje tömb , a fehérjék gyors előállítására szolgál. Erre a célra a DNS-t nagy sűrűséggel nyomtatják tömbökre, majd egy reakciópufferbe merítik. A képződött fehérjéket ezután horgonyok, úgynevezett halo-tag ligandumok fogják el . Ez a folyamat HaloTag-NAPPA néven ismert. Úgy alakult a Szék Systems Biology of Plants a TUM együtt tudósok az Egyesült Államokban és Japánban, és megjelent június 2016.

Fehérje mikro-sugarak

A fehérje -Microarray, valamint a DNS mikroarray számos tesztmezőt tartalmaz zárt terekben. A fehérje mikrorayával azonban kis mennyiségű fehérje van rögzítve a hordozóanyagon minden tesztmezőben - foltként is ismert. A csúfolásnak nevezett folyamat nagy pontosságot igényel a kis távolságra lévő kis tesztterületek miatt, ezért speciális eszközök hajtják végre.

Vagy tisztított fehérje, például antitest, vagy a vizsgált minta fehérje-keveréke alkalmazható a tömbön. Azok a foltok, amelyekben nincs interakció, a mosási lépés végrehajtása után üresek maradnak. A detektálási módszer ezután lehetővé teszi a foltok megkülönböztetését fehérje-fehérje interakcióval és anélkül. Kvantitatív detektálási módszerek is lehetségesek, amelyekben meghatározható a tapadó fehérje mennyisége.

A fehérje mikro-sugarak típusai

Microarrays

A különböző típusú fehérje microarray lehet szerint differenciált típusú interakció ( antigén - antitest , enzim- szubsztrát, receptor- fehérje vagy általános protein-fehérje kölcsönhatás). Azt is meg lehet különböztetni, hogy a minta fehérjéit rögzítjük-e a tömbön, majd nagyszámú specifikus, ismert tesztfehérjével teszteljük - vagy a tesztfehérjék rögzülnek a tesztterületeken, majd a mintafehérjékkel való reakció hely.

• A reverz fázisú fehérje mikroarray módszert (más néven lizátum mikroray-nek) alkalmazzák az antigének kimutatására különféle szövetek sejtlizátumaiban vagy izoelektromos fókuszálással nyert fehérjefrakciókban. A sejtlizátumot vagy a fehérjefrakciót a mikroarray hordozóanyagára foltozzuk, majd ezt követően az antitestet alkalmazzuk. Az antitest antitest-antigén kölcsönhatással tapad minden tesztmezőhöz. Az antitestekkel rendelkező mezők ezután detektálhatók, mint a Western blot esetében . Ezt általában egy jelölt második antitest alkalmazásával hajtják végre, amely megköti az antigén-specifikus első antitestet. Ezt a második antitestet egy fluoreszcens vagy közeli infravörös festékkel kapcsolják össze, és megfelelő szkennerrel detektálják, vagy egy enzimmel, a torma-peroxidázzal párosulnak, amely lehetővé teszi a fénykibocsátó reakciót vagy a színreakciót (kromogének használata). az észlelés célja. A lizátum mikroradiák lehetővé teszik az antigén kimutatását és mennyiségi meghatározását egyszerre számos különböző lizátumban. Ezt a módszert csak az a korlátozott számú specifikus antitest korlátozza, amely egy adott antigén pontos kimutatásához szükséges.
• Antitest mikrosávok : Az antitesteket rögzítjük (foltosítjuk), majd a mintát (pl. Komplex sejtlizátumokat) visszük fel a tömbre. Az antigén kötődik a megfelelő immobilizált antitesthez (úgynevezett capture antitesthez). Ezeket a befogott antigéneket most egy második specifikus antitesttel (detektáló antitest) kell kimutatni, amelyet vagy maga jelöl, vagy pedig jelölt második antitesttel detektálunk. Ezt a komplexet ezután a címke segítségével detektálják és mennyiségileg meghatározzák (lásd ELISA ).
• Antigén mikrosugarak : Különböző antigént rögzítenek a tömb minden tesztterületén. Ha a vérminta széruma a megfelelő specifikus antitestet tartalmazza, akkor az a teszt területére tapad. Ez lehetővé teszi, hogy egyszerre számos baktérium antigénre vagy allergénre reagáljon. Az első antitestet egy jelölt második antitest köti meg egy további inkubációs lépésben, és kimutatható.
• A fehérje domén mikrotömbökben a fúziós fehérjéket rögzítik a tömbön a fehérje-fehérje kölcsönhatások detektálása céljából. A fúziós fehérje lehetővé teszi az első rész megbízható rögzítését a tömbön anélkül, hogy megzavarná a másik fehérje rész kölcsönhatását. Az alkalmazott fehérje csak azokon a vizsgálati területeken tapad, ahol kölcsönhatás van.
• A peptid mikrorajz rövid peptidszekvenciákat tartalmaz, amelyeket az eljárástól függően vagy in situ szintetizálnak , vagy közvetlenül a felszínre visznek lézernyomtatóval és szilárd fázisú szintézissel . Ennek a módszernek számos előnye van, többek között: alacsonyabb szintézis költség és nagyobb számú, párhuzamosan nyomtatható peptid. Peptid mikrorácsokat használnak többek között. enzimek profilozására , antitest epitópok vizsgálatára ( epitóp leképezés ) vagy a fehérjéhez való kötődéshez szükséges aminosavak azonosítására használják. A gyakorlatban a peptid mikrorakatok többek között. Terápiás beavatkozások nyomon követésére, a betegek rétegzésére , az egyes betegek immunválaszainak profilozására használják a betegség előrehaladtával, vagy diagnosztikai és terápiás szerek és oltások kifejlesztésére .

Az egyik lehetséges előny a DNS-mikro-sugarakkal szemben a minták gyorsabb helyszíni elemzése, mivel a genetikai anyag sokszor szükséges amplifikációjától és a hibridizációtól el lehet tekinteni. A fehérje mikrosávok lehetővé teszik a fehérje szintjének nagy áteresztőképességű elemzését is. A legújabb kutatások szerint az mRNS és a fehérje szintje nem mindig korrelál egymással. Így a cDNS mikroray eredményei nem feltétlenül jelzik a fehérje expresszióját.

Transzfekciós mikro-sugarak

Ez egy olyan technika, amelyben a DNS-t egy transzfekciós reagenssel együtt alkalmazzák a tömbön (alternatív megoldásként a tömböt a transzfekciós reagenssel foltozás után kezelhetjük). Az így előállított tömbön különféle sejtvonalakat lehet tenyészteni (lásd sejttenyészet ), amelyeket attól függően, hogy a tömbön a felülethez tapadnak-e, a megfelelő génnel transzfektálják. Ily módon sok gént lehet párhuzamosan megvizsgálni a gén és a fenotípus viszonya szempontjából egy nagy áteresztőképességű folyamatban. Ez valószínűleg a jövőben megszünteti a genomkutatás és az orvosi diagnosztika közötti szakadékot .

Szöveti mikrosávok

A szöveti mikrosugarakkal (TMA) különböző eredetű lyukasztott szövethengereket állítanak össze egy paraffin blokkra. A lyukasztó méretétől függően, általában 0,6 mm és 2 mm közötti átmérőjű, 50 és 400 minta között lehet 1,5 × 3 cm-es területet elhelyezni, ugyanakkor pl. B. immunohisztológia segítségével vizsgálni. Ezzel a módszerrel például számos mintát (pl. Különböző eredetű daganatok) lehet vizsgálni tárgylemezen, csak egy antitest alkalmazásával. Előnye itt az alacsony anyagfogyasztás, és ezzel egyidejűleg nagy számú adatrekord. Hátrányos lehet, hogy a kivágott szövetrész nem reprezentatív a teljes szövetre nézve. Ez a hátrány azonban általában csak az úgynevezett komplex szövetekben (pl. Májban) jelentkezik. A daganatos anyaggal történő szokásos alkalmazásnál ez a probléma elhanyagolható, mivel a TMA alkalmazásakor nem az egyéni eredmény a lényeg, hanem a kollektív vizsgálat eredménye. Az immunhisztológián kívül az in situ hibridizációt alkalmazó elemzések is lehetségesek (FISH, CISH).

Szénhidrát mikrorakók

A cukormolekulák most is kimutathatók a mikroarray technológiával.

történelem

A mikroray technológia csak az 1990-es években jelent meg . Az időegységenként elvégzett tesztek nagy száma, a viszonylag kis mennyiségű minta és az automatizálás egyszerűsége miatt azonban gyorsan a gyógyszerészet , az orvostudomány , a biokémia területén végzett kutatás fontos elemének bizonyult , biotechnológia , genetika és molekuláris biológia .

Ezt megelőzően, gél- alapú elektroforetikus vagy kromatográfiás módszereket használtak ezekben kutatási területeken ugyanazt a feladatot , ami sokkal több időt vesz igénybe. Egy korábbi módszer a dot blot elemzés.

A fehérje mikrosugarak esetében Ekins az 1980- as évek végén leírta, hogy a „mikrospottás vizsgálatok” rendkívül érzékenyek a kimutatásra. Hasonló megközelítéseket már leírtak az antitest makrosávok előállítására. 2000-re a genomkutatás eszközfejlesztései lehetővé tették a fehérje mikrorayák előállítását sok ezer DNS-szondával nagyon kis területen.

Lásd még

• Biochip
• DNS chip technológia

irodalom

• Hans-Joachim Müller, Thomas Röder: A kísérletező: mikrorajkák . Spectrum Academic Publishing, Heidelberg 2004, ISBN 3-8274-1438-5 .
• Carolyn R Cho, Mark Labow, Mischa Reinhardt, Jan van Oostrum, Manuel Peitsch: A rendszerbiológia alkalmazása a gyógyszerkutatásban. In: Jelenlegi vélemény a kémiai biológiában. 10., 2006, 294-302.
• J. Packeisen, E. Korsching, H. Herbst, W. Boecker, H. Buerger: Demisztifikált ... szöveti mikroarray technológia. In: Mol Pathol. 56. (4), 2003. augusztus, 198-204.
• JH Malone, B. Oliver: Mikro-sugarak, mély szekvenálás és a transzkriptóm valódi mértéke. In: BMC Biológia. 9., 2011., 34. o. (Áttekintés) doi: 10.1186 / 1741-7007-9-34

web Linkek

• Hallei Egyetemi Kórház (Saale) - Humángenetikai Intézet: Array-CGH-Diagnostics (a kópiaszám-variációk (CNV) meghatározásának módszere és alkalmazása).
• Mayday - szabadon elérhető szoftver a mikroarray elemzéshez
• Animáció a működéséről

Egyéni bizonyíték

1. ↑ HaloTag-NAPPA TU-München
2. ↑ HaloTag-NAPPA kiadvány
3. ↑ Volker Stadler, Thomas Felgenhauer, Mario Beyer, Simon Fernandez, Klaus Leibe: A peptidtömbök kombinatorikus szintézise lézernyomtatóval . In: Angewandte Chemie International Edition . szalag 47 , no. 37. , 2008. szeptember 1., ISSN  1521-3773 , p. 7132-7135 , doi : 10.1002 / anie.200801616 . 
4. ↑ Frank Breitling, Thomas Felgenhauer, Alexander Nesterov, Volker Lindenstruth, Volker Stadler: A peptidtömbök részecskalapú szintézise . In: ChemBioChem . szalag 10 , no. 5. , 2009. március 23., ISSN  1439-7633 , p. 803-808 , doi : 10.1002 / cbic.200800735 .