Microarray

Microarray on yhteinen termi nykyaikaisille molekyylibiologisille tutkimusjärjestelmille, jotka mahdollistavat useiden tuhansien yksittäisten tuotteiden rinnakkaisen analysoinnin pienessä määrässä biologista näytemateriaalia. Mikrosäteitä on erilaisia, joita kutsutaan joskus myös " geenisiruiksi " tai "mikrosiruiksi ", koska ne, kuten tietokone siru, voivat sisältää paljon tietoa hyvin pienessä tilassa.

DNA-mikrosirut

Toista mediatiedosto

DNA-mikrosiru tulostetaan robotilla.

DNA-mikrosäteitä käytetään genomianalyysissä , diagnostiikassa ja erilaisten geeniekspressioiden tutkimuksissa . DNA-mikrosäteitä käytetään tiettyjen geenien mRNA: n ja ncRNA: n tai tiettyjen organismien rRNA: n määrän havaitsemiseen. DNA-mikrosäteitä on pääasiassa kahta erityyppistä, toisaalta niitä, joissa mDNA: ta ja ncRNA: ta vastaavat cDNA , oligonukleotidit tai PCR-tuotteiden fragmentit on painettu kantaja-aineelle ("täplämikrosäteet"), ja niitä, joissa synteettiset valmistetut oligonukleotidit perustuvat ("oligonukleotidimikrosäteet"). Nämä toimivat koettimina, jotka on kiinnitetty määriteltyihin ruudukon kohtiin. B. levitetään lasikannattimille.

• NAPPA , Englanti varten nukleiinihappo ohjelmoitavan proteiinijärjestelmän , käytetään nopeaan proteiinien tuotantoa. Tätä tarkoitusta varten DNA tulostetaan suuritiheyksisenä matriiseihin ja upotetaan sitten reaktiopuskuriin. Muodostuneet proteiinit siepataan sitten ankkureilla, ns. Halo-tag- ligandeilla . Tämä prosessi tunnetaan nimellä HaloTag-NAPPA. Se on kehittänyt puhetta systeemibiologian kasveja klo TUM yhdessä tutkijoiden Yhdysvalloista ja Japanista, ja julkaistiin päivänä kesäkuuta 2016.

Proteiinimikrosäteet

Proteiini -Microarray sekä DNA-mikrosiru sisältää useita koepeltoja ahtaissa tiloissa. Proteiinimikrosiruilla kiinnitetään kuitenkin pieniä määriä proteiinia kantaja-aineeseen kussakin testikentässä - joka tunnetaan myös nimellä pilkku. Prosessia kutsutaan ilkkuva vaatii suurta tarkkuutta, koska pieni testi alueilla lyhyen matkan, ja on sen vuoksi suorittaa muilla laitteilla.

Joko puhdistettua proteiinia, esimerkiksi vasta-ainetta, tai testatun näytteen proteiiniseosta voidaan nyt käyttää ryhmään. Pisteet, joissa ei tapahdu vuorovaikutusta, jäävät tyhjiksi pesuvaiheen suorittamisen jälkeen. Detektiomenetelmä sallii sitten eron pisteiden välillä proteiini- proteiini-vuorovaikutuksella tai ilman. Myös kvantitatiiviset detektiomenetelmät, joissa kiinnittyvän proteiinin määrä voidaan määrittää.

Tyypit proteiinimikrosäteitä

Mikrosäteet

Erityyppiset proteiinimikrosäteet voidaan erottaa vuorovaikutustyypin mukaan ( antigeeni - vasta-aine , entsyymi- substraatti, reseptori- proteiini tai yleinen proteiini-proteiini-vuorovaikutus). Voidaan myös erottaa, kiinnitetäänkö näytteen proteiinit ryhmään ja testataanko sitten suurella määrällä spesifisiä, tunnettuja testiproteiineja - vai kiinnittyykö testiproteiinit testialueille ja sitten reaktio näyteproteiinien kanssa kestää paikka.

• Käänteisfaasi Proteiinimikrosirun menetelmä (jota kutsutaan myös lysaatti microarray) käytetään havaitsemaan antigeenejä solulysaateista eri kudoksissa tai proteiini saatujen fraktioiden mukaan isoelektrisellä fokusoinnilla . Solulysaatti tai proteiinifraktio täplitetään mikrorakeen kantaja-aineelle, minkä jälkeen vasta-aine levitetään. Vasta-aine tarttuu jokaiseen testikenttään vasta-aine-antigeeni-vuorovaikutuksella. Kentät, joissa on vasta-aineita, voidaan sitten havaita kuten Western blot -menetelmällä . Tämä tehdään yleensä käyttämällä leimattua toista vasta-ainetta, joka sitoo antigeenispesifisen ensimmäisen vasta-aineen. Tämä toinen vasta-aine kytketään sitten fluoresoivaan tai lähellä olevaan infrapunaväriin ja se havaitaan sopivalla skannerilla tai se on yhdistetty entsyymiin, piparjuuriperoksidaasiin, mikä sallii valoa emittoivan reaktion tai värireaktion (kromogeenien käyttö). havaitsemisen tarkoitus. Lysaattimikrosäteet mahdollistavat antigeenin havaitsemisen ja kvantifioinnin monissa eri lysaateissa samanaikaisesti. Tätä menetelmää rajoittaa vain rajoitettu määrä spesifisiä vasta-aineita, joita tarvitaan spesifisen antigeenin tarkkaan havaitsemiseen.
• Vasta-ainemikrosäteet : Vasta- aineet kiinnitetään (täplikäs) ja sitten näyte (esim. Kompleksiset solulysaatit) levitetään ryhmään. Antigeeni sitoutuu vastaavaan immobilisoituun vasta-aineeseen (niin kutsuttu sieppausvasta-aine). Nämä siepatut antigeenit on nyt detektoitava toisella spesifisellä vasta-aineella (detektiovasta-aine), joka sitten joko leimataan itse tai havaitaan leimatulla toisella vasta-aineella. Tämä kompleksi havaitaan ja kvantifioidaan sitten leiman avulla (katso ELISA ).
• Antigeenimikrosäteet : Eräs antigeeni kiinnitetään ryhmän jokaiselle testialueelle. Jos verinäytteen seerumi sisältää vastaavan spesifisen vasta-aineen, se tarttuu testialueeseen. Tämä antaa mahdollisuuden testata reaktiota suureen määrään bakteeriantigeeneja tai allergeeneja samanaikaisesti. Ensimmäinen vasta-aine on sitoutunut leimatulla toisella vasta-aineella seuraavassa inkubointivaiheessa ja se voidaan havaita.
• In proteiinidomeeni mikrosiruja , fuusioproteiinit on kiinnitetty array, jotta voidaan havaita proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia. Fuusioproteiini mahdollistaa luotettavan kiinnityksen ryhmään ensimmäisen osan kanssa häiritsemättä toisen proteiiniosan vuorovaikutuskykyä. Levitetty proteiini tarttuu vain niihin testialueisiin, joilla on vuorovaikutus.
• Peptidi mikrosiru sisältää lyhyitä peptidin sekvenssit, jotka menetelmästä riippuen, on joko syntetisoitu in situ tai levitetään suoraan pinnalle käyttämällä lasertulostin ja kiinteän faasin synteesiä . Tällä menetelmällä on useita etuja, mukaan lukien: pienemmät synteesikustannukset ja suurempi määrä peptidejä, jotka voidaan tulostaa rinnakkain. Peptidimikrosäteitä käytetään muun muassa. käytetään entsyymien profilointiin , vasta-aineepitooppien tutkimiseen ( epitooppikartoitus ) tai proteiiniin sitoutumiseen tarvittavien aminohappojen tunnistamiseen. Käytännössä peptidimikrosäteet ovat muun muassa. Käytetään terapeuttisten toimenpiteiden seurantaan, potilaiden kerrostumiseen , yksittäisten potilaiden immuunivasteiden profilointiin taudin edetessä tai diagnostisten ja terapeuttisten aineiden ja rokotusten kehittämiseen .

Yksi mahdollinen etu DNA-mikrosäteisiin nähden on näytteiden nopeampi analyysi paikan päällä, koska usein välttämätön geneettisen materiaalin monistaminen ja hybridisaatio voidaan jättää pois. Proteiinimikrosäteet mahdollistavat myös proteiinitason korkean läpäisykyvyn analyysin. Viimeisimmät tutkimukset viittaavat siihen, että mRNA- ja proteiinitasot eivät aina korreloi keskenään. Siten cDNA-mikropiiputulokset eivät välttämättä osoita proteiinin ilmentymistä.

Transfektiomikrosäteet

Tämä on tekniikka, jossa DNA: ta levitetään ryhmään yhdessä transfektioreagenssin kanssa (vaihtoehtoisesti ryhmää voidaan käsitellä transfektioreagenssilla tiputtamisen jälkeen). Eri solulinjoja voidaan viljellä tällä tavalla valmistetulla ryhmällä (katso soluviljely ), joka transfektoidaan vastaavalla geenillä riippuen siitä, missä ryhmässä ne tarttuvat pintaan. Tällä tavoin monia geenejä voidaan tutkia rinnakkain geenin ja fenotyypin suhteen suuritehoisessa prosessissa. Tämä todennäköisesti sulkee kuilun genomitutkimuksen ja lääketieteellisen diagnostiikan välillä tulevaisuudessa.

Kudosmikrosäteet

Kudosmikrosäteillä (TMA) kootut eri alkuperää olevat rei'itetyt kudossylinterit parafiinilohkoon. Rei'ittimen koosta riippuen, yleensä halkaisijaltaan 0,6 - 2 mm, 50 - 400 näytettä voidaan sijoittaa 1,5 × 3 cm: n alueelle ja samalla esim. B. tutkitaan immunohistologian avulla . Tällä menetelmällä esimerkiksi useita näytteitä (esim. Eri alkuperää olevat kasvaimet) voidaan tutkia objektilasilla vain yhdellä vasta-aineella. Etuna on tässä pieni materiaalikulutus ja samalla suuri määrä saatuja tietueita. Voi olla haitallista, että lävistetty kudososa ei edusta koko kudosta. Tämä haitta esiintyy kuitenkin yleensä vain ns. Monimutkaisissa kudoksissa (esim. Maksassa). Tavanomaisessa kasvainmateriaalia käyttävässä sovelluksessa tämä ongelma voidaan jättää huomiotta, koska TMA: ta sovellettaessa ei ole tärkeä yksittäinen tulos, vaan kollektiivisen tutkimuksen tulokset. Immunohistologian käytön lisäksi myös in situ -hybridisaatiota käyttävät analyysit ovat mahdollisia (FISH, CISH).

Hiilihydraattimikrosäteet

Sokerimolekyylit voidaan nyt havaita myös mikrorake-tekniikalla.

historia

Microarray-tekniikka syntyi vasta 1990-luvulla . Koska testejä on paljon aikayksikköä, verrattain pieni määrä näytteitä ja helppous, jolla se voidaan automatisoida, se on nopeasti vakiinnuttanut asemansa tärkeänä komponenttina farmasian , lääketieteen , biokemian tutkimuksessa. , biotekniikka , genetiikka ja molekyylibiologia .

Sitä ennen, geeli perustuu elektroforeettisen tai kromatografisia menetelmiä käytettiin näissä tutkimusaloilla samaan tehtävään , jotka olivat paljon enemmän aikaa vievää. Aikaisempi menetelmä on dot blot -analyysi.

Proteiinimikrosäteille Ekins kuvasi 1980- luvun lopulla, että “mikrospottimääritykset” ovat erittäin herkkiä havaitsemiselle. Samanlaisia ​​lähestymistapoja on jo kuvattu vasta-ainemakrosäteiden tuotannossa. Vuoteen 2000 mennessä genomitutkimuksen laitekehitys mahdollisti proteiinimikrosäteiden tuottamisen tuhansilla DNA-koettimilla hyvin pienellä alueella.

Katso myös

• Biochip
• DNA-sirutekniikka

kirjallisuus

• Hans-Joachim Müller, Thomas Röder: Kokeilija: mikrosäteet . Spectrum Academic Publishing House, Heidelberg 2004, ISBN 3-8274-1438-5 .
• Carolyn R Cho, Mark Labow, Mischa Reinhardt, Jan van Oostrum, Manuel Peitsch: Systeemibiologian soveltaminen lääkkeiden löytämiseen. Julkaisussa: Current Opinion in Chemical Biology. 10, 2006, s. 294-302.
• J. Packeisen, E. Korsching, H. Herbst, W. Boecker, H. Buerger: Demystifioitu ... kudosmikrosirutekniikka . Julkaisussa: Mol Pathol. 56 (4), 2003 elokuu, s. 198-204.
• JH Malone, B.Oliver: Mikrosäteet, syvä sekvensointi ja transkription todellinen mitta. Julkaisussa: BMC Biology. 9, 2011, s. 34. (Katsaus) doi: 10.1186 / 1741-7007-9-34

nettilinkit

• Yliopistosairaala Halle (Saale) - Ihmisen genetiikan instituutti: Array-CGH-Diagnostics (menetelmä ja soveltaminen kopioluvumuutosten, CNV) määrittämiseen.
• Mayday - vapaasti saatavilla oleva ohjelmisto mikrokerrosanalyysiä varten
• Animaatio sen toiminnasta

Yksittäiset todisteet

1. ↑ HaloTag-NAPPA TU-München
2. ↑ HaloTag-NAPPA-julkaisu
3. ↑ Volker Stadler, Thomas Felgenhauer, Mario Beyer, Simon Fernandez, Klaus Leibe: Peptidiryhmien yhdistelmäsynteesi lasertulostimella . Julkaisussa: Angewandte Chemie International Edition . nauha 47 , ei. 37 , 1. syyskuuta 2008, ISSN  1521-3773 , s. 7132-7135 , doi : 10.1002 / anie.200801616 . 
4. ↑ Frank Breitling, Thomas Felgenhauer, Alexander Nesterov, Volker Lindenstruth, Volker Stadler: Peptidiryhmien hiukkaspohjainen synteesi . Julkaisussa: ChemBioChem . nauha 10 , ei. 5 , 23. maaliskuuta 2009, ISSN  1439-7633 , s. 803-808 , doi : 10.1002 / cbic.200800735 .