Микрочип

Микроматрица - это собирательный термин для современных систем молекулярно-биологических исследований, которые позволяют проводить параллельный анализ нескольких тысяч отдельных объектов в небольшом количестве материала биологического образца. Существуют различные формы микрочипов, которые иногда также называют «генными чипами» или « биочипами », потому что, как и компьютерный чип, они могут содержать большой объем информации в очень маленьком пространстве.

Cdnaarray.jpg

ДНК-микрочипы

Микроматрица ДНК печатается роботом.

ДНК-микрочипы используются в геномном анализе , диагностике и исследованиях дифференциальной экспрессии генов . ДНК-микрочипы используются для определения количества мРНК и нкРНК определенных генов или рРНК определенных организмов. В основном существуют два разных типа микроматриц ДНК: с одной стороны, те, в которых кДНК , олигонуклеотиды или фрагменты продуктов ПЦР, соответствующие мРНК и нкРНК, напечатаны на материале носителя («пятнистые микроматрицы»), и те, в которых синтетические произведенные олигонуклеотиды основаны («олигонуклеотидные микрочипы»). Они служат в качестве датчиков, которые прикрепляются к определенным позициям на сетке, для. Б. применяться для стеклянных носителей.

  • NAPPA , английский язык для кислотного программируемой матрицы нуклеиновой белка , используется для быстрого производства белков. Для этого ДНК печатается с высокой плотностью на массивах, а затем погружается в реакционный буфер. Образующиеся белки затем захватываются якорями, так называемыми лигандами галоген-меток . Этот процесс известен как HaloTag-NAPPA. Она была разработана кафедрой для системной биологии растений в ТУМЕ вместе с учеными из США и Японии, а также опубликована в июне 2016 года.

Белковые микрочипы

Белок -Microarray, а также ДНК - микрочипов включает в себя множество тестовых полей в замкнутых пространствах. Однако с помощью белковой микроматрицы небольшие количества белка фиксируются на материале носителя в каждом тестовом поле, также известном как пятно. Процесс , называемый насмешливая требует высокого уровня точности из - за небольших пробных площадей на небольшом расстоянии , и поэтому осуществляется с помощью специальных устройств.

Теперь на матрицу можно нанести очищенный белок, например антитело, или смесь белков тестируемого образца. Те пятна, в которых не происходит взаимодействия, остаются пустыми после того, как был выполнен этап стирки. Затем метод обнаружения позволяет различать пятна с взаимодействием белок-белок и без него. Также возможны количественные методы обнаружения, с помощью которых можно определить количество прилипшего белка.

Типы белковых микрочипов

Image
Микрочипы

Различные типы белковых микрочипов могут быть дифференцированы в зависимости от типа взаимодействия ( антиген - антитело , фермент - субстрата, рецептор белка или общего взаимодействия белок-белок). Также можно дифференцировать, фиксируются ли белки образца на матрице, а затем тестируются с большим количеством конкретных известных тестовых белков - или тестовые белки фиксируются в тестовых областях, и тогда реакция с белками образца происходит место.

  • Метод микроматрицы с обращенной фазой (также называемой микроматрицей лизата) используется для обнаружения антигенов в клеточных лизатах различных тканей или во фракциях белков, полученных с помощью изоэлектрического фокусирования . Лизат клеток или белковая фракция наносится на материал носителя микрочипа, после чего наносится антитело. Антитело прилипает к каждому испытательному полю за счет взаимодействия антитело-антиген. Поля с антителами затем могут быть обнаружены, как при вестерн-блоттинге . Обычно это делается с использованием меченого второго антитела, которое связывает антиген-специфическое первое антитело. Это второе антитело затем связывается с флуоресцентным или ближним инфракрасным красителем и обнаруживается с помощью соответствующего сканера или связывается с ферментом, пероксидазой хрена, который обеспечивает светоизлучающую или цветовую реакцию (использование хромогенов) для цель обнаружения. Микроматрицы лизата позволяют одновременно обнаруживать и количественно определять антиген во многих различных лизатах. Этот метод ограничен только ограниченным количеством специфических антител, необходимых для точного обнаружения специфического антигена.
  • Микроматрицы антител : антитела фиксируются (наносятся пятнами), а затем образец (например, сложные клеточные лизаты) наносится на матрицу. Антиген связывается с соответствующим иммобилизованным антителом (так называемое захватывающее антитело). Эти захваченные антигены теперь должны быть обнаружены вторым специфическим антителом (обнаруживающим антителом), которое затем либо метят само, либо обнаруживают с помощью второго меченого антитела. Затем этот комплекс обнаруживают и количественно определяют с помощью метки (см. ELISA ).
  • Антигенные микроматрицы : разные антигены фиксируются на каждой тестовой области матрицы. Если сыворотка образца крови содержит соответствующее специфическое антитело, оно прилипнет к тестовой области. Это позволяет одновременно тестировать реакцию на большое количество бактериальных антигенов или аллергенов. Первое антитело связывается с помеченным вторым антителом на дальнейшей стадии инкубации и может быть обнаружено.
  • В микромассивах белковых доменов слитые белки фиксируются на матрице для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Слитый белок обеспечивает надежную фиксацию на матрице с первой частью, не нарушая возможности взаимодействия другой части белка. Нанесенный протеин прилипает только к тем тестовым участкам, где происходит взаимодействие.
  • Пептид микрочипов содержит короткие пептидные последовательности , которые, в зависимости от метода, либо синтезированные на месте или наносить непосредственно на поверхность с помощью лазерного принтера и твердофазного синтеза . Этот метод имеет несколько преимуществ, в том числе: меньшие затраты на синтез и большее количество пептидов, которые можно печатать параллельно. Среди прочего используются пептидные микроматрицы. используется для профилирования ферментов , для исследования эпитопов антител ( картирование эпитопов ) или для идентификации аминокислот, которые необходимы для связывания с белками. На практике, помимо прочего, используются пептидные микроматрицы. Используется для мониторинга терапевтических вмешательств, стратификации пациентов, профилирования иммунных ответов отдельных пациентов по мере прогрессирования заболевания или для разработки диагностических и терапевтических агентов и вакцинаций .

Одним из возможных преимуществ перед ДНК-микрочипами является более быстрый анализ образцов на месте, поскольку можно обойтись без часто необходимой амплификации генетического материала и гибридизации . Белковые микрочипы также позволяют проводить высокопроизводительный анализ уровня белка. Последние исследования показывают, что уровни мРНК и белка не всегда коррелируют друг с другом. Таким образом, результаты микроматрицы кДНК не обязательно указывают на экспрессию белка.

Микроматрицы трансфекции

Это метод, при котором ДНК наносится на матрицу вместе с реагентом для трансфекции (альтернативно, матрица может быть обработана реагентом для трансфекции после нанесения пятен). Различные клеточные линии можно культивировать на матрице, приготовленной таким образом (см. Культуру клеток ), которая, в зависимости от того, где на матрице они прикрепляются к поверхности, трансфицируется соответствующим геном. Таким образом, можно параллельно исследовать многие гены на предмет взаимосвязи между геном и фенотипом в высокопроизводительном процессе. Это, вероятно, сократит разрыв между исследованиями генома и медицинской диагностикой в будущем.

Тканевые микроматрицы

С помощью тканевых микрочипов (ТМА) перфорированные тканевые цилиндры различного происхождения собираются на парафиновом блоке. В зависимости от размера пуансона, обычно от 0,6 мм до 2 мм в диаметре, от 50 до 400 образцов могут быть размещены на площади 1,5 × 3 см и в то же время, например, Б. обследоваться с помощью иммуногистологии . С помощью этого метода, например, можно исследовать многочисленные образцы (например, опухоли различного происхождения) на предметном стекле с помощью всего лишь одного нанесения антитела. Преимущество здесь - низкий расход материала и, в то же время, большое количество получаемых записей данных. Недостатком может быть то, что вырезанный срез ткани не является репрезентативным для всей ткани. Однако этот недостаток обычно возникает только в так называемых сложных тканях (например, печени). При обычном применении с опухолевым материалом этой проблемой можно пренебречь, поскольку при применении ТМА имеет значение не индивидуальный результат, а результаты коллективного обследования. Помимо использования в иммуногистологии, также возможны анализы с использованием гибридизации in situ (FISH, CISH).

Углеводные микрочипы

Молекулы сахара теперь также можно обнаруживать с помощью технологии микрочипов.

история

Технология микрочипов не появлялась до 1990-х годов . Однако из-за большого количества тестов в единицу времени, сравнительно небольшого количества образцов и простоты, с которой его можно автоматизировать, он быстро зарекомендовал себя как важный компонент в исследованиях в области фармации , медицины , биохимии. , биотехнология , генетика и молекулярная биология .

До этого, гелеобразные на основе электрофоретических или хроматографические методы были использованы в этих областях исследований для одной и той же задачи , которые были намного больше времени. Предыдущий метод - это дот-блот- анализ.

Что касается белковых микрочипов, Экинс описал в конце 1980 - х, что «анализ микропятен» чрезвычайно чувствителен к обнаружению. Подобные подходы уже были описаны для получения макромассивов антител. К 2000 году разработка устройств для исследования генома позволила производить белковые микрочипы с тысячами ДНК-зондов на очень небольшой площади.

Смотри тоже

литература

  • Ханс-Йоахим Мюллер, Томас Рёдер: Экспериментатор: микроматрицы . Издательство Spectrum Academic, Гейдельберг 2004 г., ISBN 3-8274-1438-5 .
  • Кэролайн Р. Чо, Марк Лабоу, Миша Рейнхардт, Ян ван Оострум, Мануэль Пайч: применение системной биологии к открытию лекарств. В: Текущее мнение в химической биологии. 10, 2006, стр. 294-302.
  • J. Packeisen, E. Korsching, H. Herbst, W. Boecker, H. Buerger: Демистифицированная ... технология тканевых микрочипов. В: Мол Патол. 56 (4), август 2003 г., стр. 198-204.
  • Дж. Х. Мэлоун, Б. Оливер: микроматрицы, глубокое секвенирование и истинная мера транскриптома. В: Биология BMC. 9, 2011, стр. 34. (Обзор) doi: 10.1186 / 1741-7007-9-34

веб ссылки

Индивидуальные доказательства

  1. ↑ HaloTag-НАППА ТУ-Мюнхен
  2. ↑ Публикация HaloTag-NAPPA
  3. ↑ Фолькер Стадлер, Томас Фельгенгауэр, Марио Бейер, Саймон Фернандес, Клаус Лейбе: Комбинаторный синтез пептидных массивов с помощью лазерного принтера . В: Angewandte Chemie International Edition . Лента 47 , нет. 37 , 1 сентября 2008 г., ISSN  1521-3773 , с. 7132-7135 , DOI : 10.1002 / anie.200801616 .
  4. ↑ Франк Брайтлинг, Томас Фельгенгауэр, Александр Нестеров, Фолькер Линденструт, Фолькер Штадлер: Синтез пептидных массивов на основе частиц . В: ChemBioChem . Лента 10 , вып. 5 , 23 марта 2009 г., ISSN  1439-7633 , с. 803-808 , DOI : 10.1002 / cbic.200800735 .