NUMT - NUMT
NUMT , udtales som "ny magt", er et akronym for " nu clear m i t ochondrial DNA" segment, der er udviklet af evolutionær genetiker, Jose V. Lopez , som beskriver en transponering af enhver form for cytoplasmatisk mitokondrielt DNA i nukleære genom af eukaryote organismer .
Flere og flere NUMT -sekvenser, med forskellig størrelse og længde, i det mangfoldige antal eukaryoter, er blevet påvist, efterhånden som mere hel genom -sekvensering af forskellige organismer akkumuleres. Faktisk er NUMT'er ofte utilsigtet blevet opdaget af forskere, der ledte efter mtDNA ( mitokondrielt DNA ). NUMT er blevet rapporteret i alle undersøgte eukaryoter, og næsten alle mitokondrielle genomområder kan integreres i atomgenomet. NUMT'er er imidlertid forskellige i antal og størrelse på tværs af forskellige arter. Sådanne forskelle skyldes muligvis interspecifik variation i faktorer som kønsstabilitet og mitokondrier. Efter frigivelsen af mtDNA til cytoplasmaet , på grund af den mitokondrielle ændring og morfologiske ændringer, overføres mtDNA til kernen ved en af de forskellige forudsagte metoder og indsættes til sidst ved dobbeltstrengede brudreparationsprocesser i det nukleare DNA (nDNA) . Der er ikke kun fundet en sammenhæng mellem brøkdelen af ikke-kodende DNA og NUMT-overflod i genomet, men NUMT'er har også vist sig at have ikke-tilfældig fordeling og en større sandsynlighed for at blive indsat i en bestemt genom i forhold til andre. Afhængigt af placeringen af indsættelsen kan NUMT'er forstyrre genernes funktion. Derudover har De novo -integration af NUMT -pseudogener i atomgenomet en negativ virkning i nogle tilfælde, hvilket fremmer forskellige lidelser og aldring.
Den første anvendelse af NUMT-udtrykket i huskatten ( Felis catus ) -eksemplet var slående, da mitokondrielt genantal og indhold blev forstærket 38-76X i kattens atomgenom, udover at blive transponeret fra cytoplasmaet. Kattens NUMT -sekvenser syntes ikke at være funktionelle på grund af fundet af flere mutationer, forskellene i mitokondrielle og nukleare genetiske koder og den tilsyneladende indsættelse inden for typisk inerte centromerområder. Tilstedeværelsen af NUMT -fragmenter i genomet er ikke problematisk for alle arter; for eksempel er det vist, at sekvenser af mitokondriel oprindelse fremmer nuklear DNA -replikation i Saccharomyces cerevisiae . Selvom den udvidede translokation af mtDNA-fragmenter og deres co-amplifikation med frit mitokondrielt DNA har været problematisk i diagnosen mitokondrielle lidelser, i undersøgelsen af populationsgenetik og fylogenetiske analyser , har forskere brugt NUMT som de genetiske markører til at finde ud af relativ hastighed for nukleare og mitokondrielle mutationer og genskabelse af det evolutionære træ.
Kort historik for NUMT
Ved endosymbiose-teorien , der opnåede accept omkring 1970'erne, var mitokondrien som en stor energifabrik i cellen tidligere en fritlevende prokaryote, der invaderede en eukaryot celle. Under denne teori overførte symbiotiske organeller gradvist deres gener til det eukaryote genom, hvilket indebar, at mtDNA gradvist blev integreret i atomgenomet. På trods af de metaboliske ændringer og funktionelle tilpasninger i værtens eukaryoter er cirkulært mitokondrielt DNA indeholdt i organellerne. Mitokondrie -DNA, der indeholder 37 gener, spiller en væsentlig rolle i produktionen af nødvendige forbindelser, såsom nødvendige enzymer til mitokondriers funktion. Specifikt er det blevet foreslået, at visse gener (såsom generne for cytochromoxidase-underenheder I og II) i organellen er nødvendige for at regulere redoxbalancen gennem membranassocierede elektrontransportkæder. Disse dele af mitokondriegenomet er blevet rapporteret at være de hyppigst anvendte. Mitokondrier er ikke det eneste sted, inden for hvilket cellen mtDNA, mitokondrielt DNA, kan findes; undertiden kan overførsel af mitokondrielt DNA fra organeller til kernen forekomme; beviset for en sådan translokation er set ved sammenligning af mitokondriel DNA -sekvens med genomets sekvens af modparterne. Integrationen og rekombinationen af cytoplasmatisk mtDNA i det nukleare DNA kaldes Nuclear Mitochondrial DNA, som forkortes som NUMT. Den mulige tilstedeværelse af organelle DNA inde i atomgenomet blev foreslået efter at have fundet en homolog struktur til mitokondrie -DNA, som var kort efter opdagelsen af tilstedeværelsen af et uafhængigt DNA i organellerne i 1967. Dette emne forblev uberørt indtil 1980'erne. Indledende beviser for, at DNA kunne bevæge sig blandt cellekamre, kom, da fragmenter af chloroplast-DNA blev fundet i mitokondrielle majsgenomet ved hjælp af krydshybridisering, mellem chloroplast og mitokondrie-DNA og fysisk kortlægning af homologe regioner. Efter denne indledende observation opfandt Ellis navnet "promiskuøst DNA" for at betegne overførsel af DNA intracellulært fra den ene organel til den anden og er tilstedeværelsen af organelle DNA i flere cellulære rum. Dette er ikke kun en vigtig opdagelse i sig selv, men er også yderst informativ og nyttig til at forstå den evolutionære proces og tidsperioden, hvor forskellige forekomster kan finde sted. Søgningen efter mtDNA i nukleare DNA fortsatte indtil 1994, da den nylige bemærkelsesværdige transponering af 7,9 kb af et typisk 17,0 kb mitokondrielt genom til en specifik nuklear kromosomal position i huskatten blev rapporteret. Dette er den tid, NUMT blev opfundet til at angive de store strækninger af mitokondrielt DNA i genomet. Hidtil er hele genomerne for mange eukaryoter, både hvirveldyr og hvirvelløse dyr blevet sekventeret, og NUMT blev observeret i atomgenomet for forskellige organismer, herunder gær, Podospora , søpindsvin , johannesbrød , honningbi, Tribolium , rotte, majs , ris og primater . I Plasmodium, Anopheles gambiae og Aedes aegypti myg kan NUMT næsten ikke påvises. Derimod er de bevarede fragmenter af NUMT nu få identificeret i genomdata for Ciona intestinalis , Neurospora crassa , Schizosaccharomyces pombe , Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster og Rattus norvegicus . Antunes og Ramos blev fundet tilstedeværelsen af NUMT i fiskegenomet for første gang i 2005 ved hjælp af BLAST N, MAFFT , meget kraftige genomkortlægninger og fylogen analyse. På tværs af dyreriget er Apis mellifera , fra phylum Arthropoda og Hydra magnipapillata , fra phylum Cnidaria , henholdsvis de første og andet dyr med det højeste forhold mellem NUMT'er og den samlede størrelse af atomgenomet , mens Monodelphis Domestica eller Gray short-tailed opossum , er rekordindehaver for NUMT frekvens blandt hvirveldyr. I lighed med dyr er NUMTs rigelige i planterne, og det længste NUMT-fragment, der hidtil er kendt , blev rapporteret om en 620 kb delvist duplikeret indsættelse af 367 kb mtDNA af Arabidopsis thaliana .
Mekanisme for NUMT indsættelse
NUMT -indsættelse i atomgenomet og dets persistens i atomgenomet initieret ved fysisk levering af mitokondrielt DNA til kernen. Dette trin følger af mtDNA-integrationen i genomet gennem en ikke-homolog endeforbindelsesmekanisme under reparation af dobbeltstrengsbrud (DSB), som forudset ved at studere bagergær, Saccharomyces Cerevisiae; og slutter ved intragenomisk dynamik af amplifikation, mutation eller deletion, som også kaldes post-insertion modifikationer. Mekanismen for mtDNA -overførsel til kerne er endnu ikke fuldt ud forstået.
Overførsel af det frigivne mtDNA til kernen: Det første trin i overføringsprocessen er frigivelse af mtDNA i cytoplasmaet. Thorsness og Fox demonstrerede flytningshastigheden af mtDNA fra mitokondrier ind i kernen ved hjælp af ura3- gærstamme med et konstrueret URA3- plasmid , påkrævet gen til uracilbiosyntese, i mitokondrierne. Under formeringen af sådanne gærstammer, der bærer en nuklear ura3 -mutation, supplerer plasmid -DNA, der undslipper fra mitokondrion til kernen, uracil -biosyntetiske defekter, genopretter vækst i fravær af uracil og let scoret fænotype. Hastigheden af DNA-overførsel fra mitokondrier til kernen blev estimeret til 2 x 10-5 pr. Celle pr. Generation, mens det modsatte, i tilfælde af cox2- mutant, hastigheden for overførsel af plasmid fra kernen til mitokondrierne tilsyneladende er på mindst 100.000 gange mindre. Mange faktorer styrer hastigheden af mtDNA undslipper fra mitokondrier til kernen. Den højere mutationshastighed i mtDNA i sammenligning med nDNA i cellerne i mange organismer er en vigtig faktor, der fremmer overførsel af mitokondrielle gener til atomgenomet. En af de intergene faktorer resulterer i den højere ødelæggelsesrate for mitokondrielle makromolekyler, herunder mtDNA, er tilstedeværelsen af et højt niveau af reaktive iltarter (ROS), genereret i mitokondrier som biprodukter i ATP-syntesemekanismen. Nogle andre faktorer, der påvirker flugten af mtDNA fra mitokondrier, omfatter virkningen af mutagene midler og andre former for cellulær stress, der kan skade mitokondrier eller deres membraner, hvilket viser, at det er muligt at antage, at eksogene skadelige midler (ioniserende stråling og kemiske genotoksiske midler) øges hastigheden af mtDNA flygte ind i cytoplasmaet. Thorsness og Fox fortsatte deres forskning for at finde de endogene faktorer, der påvirker mtDNA -flugt ind i kernen. De isolerede og undersøgte 21 nukleare mutanter med forskellige kombinationer af mutationer i mindst 12 nukleare loci kaldet yme (gær mitokondrielle flugt) mutationer under forskellige miljøforhold, da nogle af disse mutationer forårsager temperaturfølsomhed. De fandt ud af disse mutationer, der forstyrrer mitokondrielle funktioner på grund af ændring af genprodukter, påvirker mitokondriel integritet og førte til mtDNA -flugt til cytoplasma. Derudover ændrer defekter i proteiner hastigheden af mtDNA -overførsel til kernen. For eksempel i tilfælde af yme1 -mutant er unormale mitokondrier målrettet mod nedbrydning af vakuolen ved hjælp af pep4 , en større proteinase, og nedbrydning øger mtDNA -flugt til kernen gennem mitofagiprocessen. Derudover fandt Thorsness og Campbell, at ved afbrydelse af pep4 falder hyppigheden af mtDNA -flugt i yme1 -stammer. Tilsvarende sænker afbrydelsen af PRC1 , som koder for carboxypeptidase Y, hastigheden af mtDNA -flugt i yme1 -gær . Beviser viser, at mitofagi er en af de mulige måder til mtDNA -overførsel til kernen og bestemt til at være den mest understøttede vej indtil nu. Nogle andre mulige veje er vist i figur 1. Den første vej, som det blev forklaret, er en yme1- mutant, der resulterer i inaktivering af YMe1p- protein, en mitokondrielokaliseret ATP-afhængig metalloproteinase , der fører til høj flugtfrekvens for mtDNA til kernen . Mitokondrier af yme1- stammen optages til nedbrydning af vakuolen oftere end vildtypestammen. Desuden har cytologiske undersøgelser foreslået flere andre mulige veje i det mangfoldige antal arter , herunder en lysering af mitokondrie -rummet, direkte fysisk forbindelse og membransmeltning mellem mitokondrier og kerne og indkapsling af mitokondrielle rum inde i kernen, som vist i figur 1 .
Forberedelse før indsættelse: Efter at have nået kernen skal mtDNA trænge ind i atomgenomet. Hastigheden af mtDNA -inkorporering i atomgenomet kan forventes at afhænge af DSB -nummeret i nDNA, DSB -reparationssystemers aktivitet og hastigheden af mtDNA -flugt fra organeller. MtDNA -indsættelse omfatter tre hovedprocesser, vist i figur 2; for det første skal mtDNA have den korrekte form og sekvens; med andre ord skal mtDNA redigeres, hvilket giver anledning til det nye redigerede sted i polynukleotidstrukturen. Mitokondrielt DNA er ikke universelt, og hos dyr, der ligner planter, viser mitokondrie-redigering meget uregelmæssige mønstre af taxonspecifik forekomst. Som vist i figur 2 er der tre mulige måder, hvorpå mtDNA kan blive forberedt på at blive indsat i det nukleare DNA. Processen afhænger hovedsageligt af den tid, mtDNA overføres til kernen. Som vist i figur 2b er direkte integration af uredigerede mtDNA-fragmenter i de nukleare genomer det mest sandsynlige og beviserne findes både i planter, Arabidopsis genom og dyr ved hjælp af forskellige metoder, herunder BLAST-baseret analyse. I dette tilfælde overføres mtDNA til kernen, hvorved redigering og introner opstår i mitokondrien senere. Hvis et gen for eksempel blev overført til kernen i en slægt, før mitokondriell redigering udviklede sig, men forblev i organellen i andre slægter, hvor redigering opstod, ville atomkopien mere ligne et redigeret transkript end til de resterende mitokondrielle kopier ved de redigerede websteder. En anden repræsenteret og mindre understøttet model, figur 2a, er den cDNA -medierede model, som intron -indeholdt mtDNA kommer ind i kernen og ved omvendt transkription af splejset og redigeret mitokondrielt transkript bliver det integreret i nDNA. Den tredje foreslåede mekanisme er direkte overførsel og integration af intronfrit mtDNA i kernen, figur 2c, hvorved redigering og introner i mitokondrien kommer og går under evolutionen. I dette tilfælde sker introduktion og fjernelse af intronen samt revers transkription inden for mitokondrier, og slutproduktet, det redigerede intronløse mtDNA, integreres i nDNA efter at være blevet overført til kernen.
Indsættelse i atomgenomet: Efter det forberedende trin er overstået, er mtDNA klar til at indsættes i atomgenomet. Baseret på NUMT-integrationsstedet og de analyserede opnåede resultater fra bagergærforsøg, antog Blanchard og Schmidt, at mtDNA indsættes i dobbeltstrenget pause (DSB) via ikke-homologe end-sammenføjningsmaskiner. Hypotesen viser sig at være bredt accepteret. Senere analyser var i overensstemmelse med involvering af NHEJ i NUMT -integration hos mennesker. Disse processer forekommer i både somatiske celler og kønsceller . Hos dyr og mennesker afhænger evnen til DSB -reparation i kønsceller imidlertid af det oogenetiske og spermatogenetiske stadie, men på grund af den lave reparationsaktivitet er modne sædceller ikke i stand til at reparere DSB. Derudover kan DSB også repareres ved homolog rekombination (HR), hvilket er mere præcist og introducerer færre fejl i reparationsprocessen, mens det endnu ikke er set i processen med indsættelse af mtDNA ;. Bortset fra kanonisk NHEJ repareres DSB'er via en mekanisme, der involverer sekvenser, der indeholder et par homologe nukleotider i enderne af en DSB, der skal ligeres. Denne mekanisme er kendt som mikrohomologi-medieret endeforbindelse forkortet MMEJ. MMEJ er den mest mutagene DSB -reparationsmekanisme på grund af generering af sletninger, indsættelse af forskellige størrelser og andre genomomlægninger hos pattedyr. Som vist i figur 3 omfatter processerne med mtDNA-indsættelse og DSB-reparation få trin, som er DNA-segmentjustering, DNA-slutbehandling, DNA-syntese og ligering. I hvert trin kræves visse proteinkomplekser for at lette forekomsten af de angivne hændelser. Som vist i figur 3, i NHEJ, den Ku70 / Ku80 heterodimer og DNA-afhængige proteinkinase (DNA-PK) , for at bringe DNA-fragmenter ender sammen, den Artemis nukleasenedbrydning og polynucleotid kinase 3'phosphatase (PNKP) , for enden forarbejdning , X -familie -DNA -polymeraser (Pol μ og Pol λ) og terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) , til DNA -syntese og XLF/XRCC4/LigIV -kompleks, til afslutning af reparationen og sammenføjning af enderne via en phosphodiesterbinding, er de involverede proteinkomplekser i DSB -reparationsproces i mange højere organismer. DNA -polymeraser (Pol μ og Pol λ) og XLF/XRCC4/LigIV -kompleks deles mellem to NHEJ- og MMEJ -reparationsmaskiner og har det samme ansvar i begge reparationsprocesser. Det første trin i MMEJ udføres af WRN- , Artemis-, DNA-PK- og XRCC4- proteinkomplekser, der behandler enderne af DSB- og mtDNA-fragmenter udover at tilpasse dem, så polymeraser og ligaser kan fuldføre NUMT-indsættelse (figur 3 ).
Efterindsættelsesmodifikation : Det komplekse mønster af NUMT i sammenligning med det enkelte mitokondrielle stykke, udseendet af ikke-kontinuerligt mitokondrielt DNA i atomgenomet og muligvis forskellig orientering af disse fragmenter er beviset på post-indsættelsesprocesser af NUMT inden for atomgenomet. Årsagen til disse komplekse mønstre kan være resultatet af flere NUMT -indsættelser på indsættelseshotspots. Derudover bidrager dobbeltarbejde efter indsættelse til NUMT diversitet. NUMT'er har ingen selvreplikerende mekanisme eller transponeringsmekanisme; derfor forventes NUMT -dobbeltarbejde at forekomme parallelt eller involvere større segmentdublikation i hastigheder, der er repræsentative for resten af genomet. Bevis for NUMT -dobbeltarbejde, der ikke er i nærheden af andre NUMT'er, er til stede i mange genomer og sker sandsynligvis som en del af segmentel dobbeltarbejde. Imidlertid synes dobbeltarbejde af nylige menneskespecifikke NUMT'er som en del af segmentel overlapning at være sjælden; hos mennesker er det kun få NUMT'er, der viser sig at have overlapning med segmentel dobbeltarbejde, og disse NUMT'er blev fundet i kun en af kopierne, mens de manglede fra de andre, hvilket tydeligt demonstrerede, at NUMT'erne blev indsat efter kopieringshændelserne. Sletning er en anden NUMT post-insertional modifikationsmetode, der endnu ikke er undersøgt i samme detaljeringsgrad som en indsættelse. Konstant erosion af fylogene signaler og høj mutationshastighed i animalsk mtDNA gør anerkendelse af en sådan modifikation, især sletning, vanskelig. Undersøgelse af de tilfælde, hvor mønsteret for tilstedeværelse -fravær af NUMT'er ikke stemmer overens med det fylogenetiske træ , bør gøre detektering af nylige NUMT -tab mulig ved hjælp af flere genomjusteringer med tilstedeværelsen af en udgruppe. Bensasson og hans teammedlemmer brugte denne metode til at estimere det ældste indsatte NUMT hos mennesker, der daterede omkring 58 millioner år siden.
Generelle egenskaber ved NUMT
Da antallet af mitokondrier og deres funktionsniveau er forskelligt på tværs af eukaryote organismer, varierer længden, strukturen og sekvensen af NUMT'er dramatisk. Forskere har fundet ud af, at de nylige NUMT-indsættelser stammer fra forskellige segmenter af mitokondriegenomet, herunder D-loop og, i nogle ekstreme tilfælde, en række næsten mitokondrielle genom i fuld længde. Sekvensen, frekvensen, størrelsesfordelingen og endda vanskelighederne ved at finde disse sekvenser i genomet varierer væsentligt blandt arter. Størstedelen af DNA -fragmenter, der overføres fra mitokondrier og plastider til atomgenomet, er mindre end 1 kb i størrelse. Alligevel findes ekstremt store fragmenter af organelle -DNA i nogle plantegener.
Da genomet udvikler sig og ændrer sig over tid ved mutation, varierer antallet af NUMT i genomet i løbet af udviklingen. NUMT kommer ind i kernen og indsætter i nDNA på forskellige tidspunkter af tiden. På grund af konstant mutation og ustabilitet af NUMT varierer ligheden mellem dette genomstræk og mtDNA meget på tværs af kongeriget Animalia og endda inden for det bestemte genom. For eksempel er det seneste antal NUMT registreret i det humane genom 755 fragmenter, der spænder fra 39 bp til næsten hele mitokondrielle sekvens i størrelse. Der er 33 paraloge sekvenser med over 80% sekvenslighed og større længde end 500 bp. Desuden er ikke alle NUMT -fragmenterne i genomet resultatet af mtDNA -migration; nogle er resultatet af forstærkning efter indsættelse. Gamle NUMT'er findes mere rigelige i det humane genom end de nylige integranter, hvilket indikerer, at mtDNA kan amplificeres, når det først er indsat. Dayama et al. udviklet en ny teknik med højt udbytte til den nøjagtige påvisning af antallet af NUMT i det humane genom kaldet dinumt . Denne metode gør det muligt for hende og hendes teammedlemmer at identificere NUMT-indsættelser af alle størrelser i hele genomerne sekventeret ved hjælp af parret ende-sekventeringsteknologi med en større følsomhed. De anvendte dinumt til 999 personer fra 1000 Genomes Project og Human Genome Diversity Project (HGDP) og gennemførte en opdateret berigelsesanalyse hos mennesker ved hjælp af disse polymorfe indsættelser. Yderligere undersøgelse og genotypning af det opdagede NUMT analyserer også alder for indsættelse, oprindelse og sekvensegenskaber. Endelig vurderede de deres potentielle indvirkning på igangværende undersøgelser af mitokondriel heteroplasmi.
Som tidligere nævnt indsættes mtDNA kun i atomgenomet, når en DSB produceres af endogene eller eksogene skadelige faktorer. Imidlertid indsættes mtDNA ikke noget sted inden for genomet. Desuden er der ingen sammenhæng mellem brøkdelen af ikke -kodende DNA og NUMT -overflod; Derudover fandt Antunes og Ramos ud af, at gamle NUMT'er fortrinsvis indsættes i de kendte og forudsagte loci, som udledt for de seneste NUMT'er i det menneskelige genom, under deres kraftige arbejde med NUMT -sekvens i fisk ved hjælp af BLASTN -analysemetode. Derfor viser det sig, at indsættelsen af NUMT i nukleært genom ikke er tilfældig baseret på disse undersøgelser. En af de bedste undersøgelser, der beviser den ikke-tilfældige fordeling og indsættelse af NUMT'er i atomgenomet, er udført af Tsuji og hans holdkammerater. Ved at bruge LAST-metoden i stedet for BLAST, hvilket gør det muligt at beregne E-værdi med højere nøjagtighed og ikke underrepræsenterer de gentagne elementer i NUMT-flanker, blev Tsuji og hans holdkammerat i stand til at karakterisere placeringen af NUMT-indsættelse præcist. De fandt ud af, at NUMT -fragmenter har tendens til at blive indsat i regionerne med høj lokal DNA -krumning eller bøjbarhed og høje A+T -rige oligomerer, især TAT. Desuden indsættes NUMT'er for det meste i åbne kromatinområder. Ved hjælp af den samme metode viste Tsuji, at NUMT normalt ikke er grupperet sammen, og de NUMT'er, der produceres af D-loop, er normalt underrepræsenterede, hvilket tydeligere fremgår mere tydeligt hos abe og mennesker i forhold til rotter og mus på grund af den totale længde af deres NUMT'er. Imidlertid fandt Tsuji også, at retrotransposon -strukturen er stærkt beriget i NUMT -flanker, og de fleste NUMT'er indsættes i nærheden af retrotransposon, mens kun få, 10 ud af 557 NUMT'er, blev indsat i en retrotransposon, de kunne ikke finde nogen klar relation på størrelse med ikke-kodende DNA og antallet af NUMT.
Konsekvenser af De Novo Integration af NUMT Inserts
NUMT'er er ikke fuldstændigt funktionsløse, og visse funktioner er forbundet med dem. Selvom indsættelsen af NUMT'er tidligere blev betragtet som funktionsløse pseudogener, er nyere humane NUMT'er vist at være en potentielt mutagent proces, der kan skade den menneskelige genoms funktionelle integritet. Akkumulering af mutation i NUMT, post-insertion ændring, mutagen mekanisme for NUMT insertion, MMEJ og NHEJ, DSB, samt det sted, hvor insertion hot spot er placeret, kan forårsage mutation og dramatiske ændringer af genomstrukturen på integrationsstedet , forstyrrer genomets funktion og udøver betydelige virkninger på ekspressionen af genetisk information. Desuden påvirker integration af mtDNA -sekvenser væsentlig den rumlige organisation af nDNA og kan spille en vigtig rolle i udviklingen af eukaryote genomer. Ud over den negative virkning af mtDNA repræsenterer de bevarede gamle NUMT'er i genomet sandsynligvis evolutionære succeser, og de bør betragtes som en potentiel evolutionær mekanisme til forbedring af genomiske kodningsområder. Desuden fandt Chatre og Ricchetti med anvendelsen af todimensionel gelelektroforese , plasmidkonstruktion , mutagenese , i en sillico-analyse af ACS- motiver og plasmidtabshastighedsanalyse, at vandrende mitokondrielle DNA'er kan påvirke replikationen af den nukleare region, hvor de er indsat. Gennem deres funktionelle bevis viste de, at sekvenser af mitokondriel oprindelse fremmer nDNA -replikation i Saccharomyces cerevisiae . NUMT'er er rige 11-bp ARS core-A konsensus-sekvens (ACS), som dens tilstedeværelse i matches til disse konsensusmotiver i Saccharomyces cerevisiae replikationsoprindelsen er nødvendig, men ikke tilstrækkelig til funktionen af replikationsoprindelse og enhver mutation i denne konsensus forårsager reduktion eller tab af DNA -replikationsaktivitet. I betragtning af den høje densitet af ACS -motiver fremstår nogle NUMT'er hovedsageligt som ACS -bærere. I modsætning hertil er replikationseffektiviteten højere i de gærstammer, der har plasmider indeholdende både NUMT og ARS. De fandt også ud af, at nogle NUMT'er kan fungere som en uafhængig replikationsgaffel og sen kromosomal oprindelse, og NUMT'er placeret tæt på eller inden for ARS giver vigtige sekvenselementer til replikering. Således kan NUMT'er fungere som den uafhængige oprindelse, når de indsættes i en passende genomisk kontekst eller påvirker effektiviteten af allerede eksisterende oprindelser.
Sygdom og lidelser: NUMT -indsættelse i genomet kan være problematisk. Transponering af NUMT'er til genom har også været forbundet med menneskelige sygdomme. De novo -integration af NUMT -pseudogener i atomgenomet har i nogle tilfælde en negativ effekt og fremmer forskellige lidelser og aldring. MtDNA -integration i kodende gener i kønscellerne har dramatiske konsekvenser for embryoudvikling og er i mange tilfælde dødelig. Få NUMT pseudogener forbundet med sygdomme findes inden for exoner eller ved exon -intron grænserne for menneskelige gener. For eksempel arver patienterne med mucolipidosesyndrom en mutation forårsaget af indsættelse af et 93bp fragment af mitokondrie ND5 i exon 2 i R403C mucolipin -genet. Dette er det første tilfælde af en arvelig lidelse på grund af NUMT -indsatsen. På trods af den lille behandlingsgruppe viste stamcelletransplantation sig at være effektiv, og lysosomale enzymniveauer syntes at normalisere sig efter transplantation i mindst ét tilfælde. Den Pallister-Hall-syndrom , en udviklingsforstyrrelse, i et andet eksempel, hvor en funktionel lidelse i en nøgle udviklingsmæssige gen resulterer fra en de novo indsættelse af en 72bp mtDNA fragment ind GLI3 exon 14 i kromosom 7 , som resulterer i det centrale og postaxial polydaktyli , bifid epiglottis, imperforeret anus, nyreabnormaliteter, herunder cystiske misdannelser, nyrehypoplasi , ektopisk ureteral implantation og anomalier i lungesegmentering, såsom bilaterale bilobede lunger. En splejsnings-mutation i det humane gen for plasmafaktor VII, der forårsager alvorlig plasmafaktor VII-mangel, blødningssygdom, skyldes en 251-bp NUMT-indsættelse. Som det sidste kendte eksempel er en 36-bp insertion i exon 9 af USH1C-genet forbundet med Usher syndrom type IC NUMT. Der er endnu ikke fundet nogen bestemt forbandelse for Usher syndrom, men en aktuel klinisk undersøgelse på 18 frivillige finder sted for at bestemme UshStats indflydelse både i en kort og en langsigtet periode. Denne undersøgelse er blevet startet i september 2013 og anslås at være udført i oktober 2023.
Aldring: Flere undersøgelser viste, at de novo -udseende af NUMT -pseudogener i somatiske cellers genom kan have etiologisk betydning for kræftfremkaldelse og ældning. For at vise sammenhængen mellem aldring og NUMT i atomgenomet brugte Cheng og Ivessa yme1-1 mutante stammer af Saccharomyces Cerevisiae, der har en højere hastighed for mtDNA-migration. Metoden er nøjagtig den samme som metoden Thorsness og Fox anvendte til at bestemme de vigtige mekanismer og faktorer for mtDNA -migration til kernen. De fandt ud af, at gærstammerne med forhøjede migrationshastigheder af mtDNA -fragmenter til kernen viste accelereret kronologisk ældning, hvorimod stammer med nedsat mtDNA -overførselshastighed til kernen udviste en forlænget CLS, kronologisk levetid, som muligvis kunne skyldes effekten af NUMT på nukleare processer, herunder DNA -replikation, rekombination og reparation samt gentranskription. Effekten af NUMT på de højere eukaryote organismer blev undersøgt af Caro og hans holdkammerater i rotterne som en modelorganisme. Ved hjælp af en real-time PCR-kvantificering, in situ hybridisering af mtDNA til nDNA og sammenligning af unge og gamle rotter kunne Caro og hans besætning ikke alene bestemme den høje koncentration af cytochromoxidase III og 16S rRNA fra mtDNA hos både unge og gamle rotter , men de kunne også finde ud af stigningen i antallet af mitokondrielle sekvenser i nDNA, når rotten bliver ældre. Baseret på disse fund kan mitokondrier således være en vigtig udløser af ældning, men det endelige mål kan også være kernen.
Kræft: Den mest frygtelige virkning af NUMT -indsættelse sker, når mtDNA indsættes i reguleringsområdet eller nukleare strukturelle gener og forstyrrer eller ændrer de vitale celleprocesser. For eksempel hjalp fluorescerende in situ hybridiseringsanalyse i primære lavgradige hjernetoplasmer med genkendelse af mtDNA lokaliseret i kernen i korrelation med en samlet stigning i mtDNA-indhold i cellen. Denne ontogen tidlige begivenhed er vigtig i disse tumors ætiologi. På samme måde er mtDNA -sekvenser i hepatomceller til stede i det nukleare genom ved et højere kopiantal i modsætning til det normale væv. Et andet eksempel ville være HeLa nDNA, der indeholder sekvenser, der hybridiserer med mtDNA -fragmenter på ca. 5 kb. En analyse viste, at nDNA af maligne celler indeholder sekvenser af mitokondrielle cytokromoxidase I , ND4 , ND4L og 12S rRNA -gener. Baseret på disse fund blev det antaget, at mtDNA -fragmenter fungerede som et mobilt genetisk element ved initiering af carcinogenese . Southern blotting er den metode, der bruges til at bestemme hyppigheden af mitokondriel indsættelse i nDNA af det normale og tumorceller fra mus og rotter, hvilket viste, at mtDNA -sekvenserne er langt flere og rigelige i nDNA af gnavere tumorceller i sammenligning med normale celler . Ved hjælp af FISH-prober, PCR og datasekventering, kortlægning og sammenligning fandt Ju og hans holdkammerat, at mitokondrie-nukleære genomfusioner forekommer med en lignende hastighed pr. Basepar af DNA som interkromosomale nukleare omlejringer, hvilket indikerer tilstedeværelsen af en høj frekvens af kontakt mellem mitokondrielt og nuklear DNA i nogle somatiske celler. Ju og hans holdkammerater undersøgte også tidspunktet for somatisk mtDNA -integration i atomgenomet ved at vurdere tilfælde, hvor en metastatisk prøve var blevet sekventeret ud over den primære tumor. I nogle tilfælde er mtDNA -overførsler til kernen i somatiske celler meget hyppige og kan forekomme efter neoplastisk dannelse og i løbet af den subklonale udvikling af kræft, hvilket tyder på, at denne hændelse forekommer i de almindelige forfædre kræftkloner eller i normale somatiske celler forud for neoplastisk ændring. Disse fund viste, at tilstedeværelsen af direkte korrelation mellem NUMT og kræft i forskellige kropsorganer. At forstå forholdet, tidspunktet for NUMT -indsættelsen, placeringen af indsættelsen og forstyrrede gener ville hjælpe med at producere mere kraftfuld og effektiv medicin.
Eksperimentelle anvendelser og fejl
Selvom forståelse af ikke-tilfældig indsættelse af NUMT og udførelse af en bestemt funktion efter indsættelse, hjælper med at afsløre strukturen og bestemmer genomets fulde funktion, især menneskets genom, er NUMT'er blevet brugt som eksperimentelle værktøjer og har været gavnlige inden for forskellige biologiske felter selv inden du har viden om NUMTs funktion. F.eks. Kan NUMT'er bruges ikke kun som genetiske markører, men også som et redskab til at forstå den relative mutationshastighed i kernen og mitokondrierne samt genskabe evolutionære træer. Den fortsatte proces med NUMT -integration i atomgenomet fremgår af fundet af NUMT'er, der er indsat i det menneskelige genom efter divergensen mellem mennesker og chimpanser. Nogle af disse NUMT'er er variable med hensyn til den genomiske tilstedeværelse eller fravær, hvilket indikerer, at de først er opstået for nylig i den menneskelige befolkning, hvilket tillader dem at blive brugt som genetiske markører for slægt. Ved hjælp af en protokol baseret på genomjustering til at estimere antallet af NUMT i nært beslægtede arter, kunne Hazkani-Covo og Graur ikke kun identificere evolutionære begivenheder, der kan have påvirket NUMT-sammensætning i hvert genom, men kunne også rekonstruere NUMT-makeup i den fælles forfader til menneske og chimpanse. NUMT'er kan også bruges til at sammenligne hastigheden af ikke -funktionel nuklear sekvensudvikling med funktionel mtDNA og bestemme udviklingshastigheden ved hastigheden af mutationsakkumulering langs NUMT -sekvenser over tid. De mindst selektivt begrænsede regioner er segmenterne med mest afvigelse fra den mitokondrielle sekvens. En af de mest lovende anvendelser af NUMT -undersøgelse er dens anvendelse i undersøgelsen af atommutation. I metazoans betragtes NUMT'er som ikke-funktionelle. Derfor kan nukleare mutationer skelnes fra mitokondrielle ændringer, og undersøgelsen af nukleotidsubstitution, indsættelse og deletion ville være mulig. Derudover tillader homologien af paraloge NUMT -sekvenser med mtDNA at teste for lokale sekvenseffekter på mutation. Alle disse oplysninger opnået fra undersøgelsen af NUMT -fragmenter kunne bruges til at forstå mitokondriel udvikling såvel som evolutionære processer gennem historien.
NUMT'er giver mulighed for at studere gammel mangfoldighed af mitokondrielle slægter og at opdage forhistorisk hybridisering mellem arter. Gammel hybridisering er først blevet opdaget (ved hjælp af NUMT) i børstehår, derefter i colobine aber og senest i en direkte menneskelig forfader. Hominidhybridiseringen skete omkring tidspunktet for adskillelse mellem mennesker / chimpanse / gorilla . Denne sidstnævnte undersøgelse vedrører et menneskeligt NUMT, der deles med chimpanse og gorilla. Fælles fylogeni af de tre NUMT -sekvenser og mitokondrielle genomer af store aber indebærer, at en fælles forfader til de tre NUMT'er er blevet overført til human/chimpanse/gorilla -afstamning fra en hominidart adskilt fra dem med omkring 4,5 millioner års mtDNA -udvikling. Selvom hybridisering af denne størrelse ikke er uhørt blandt primater, er dens forekomst i den direkte menneskelige slægt, omkring den kritiske tid for menneskelig/abespeciering, et opsigtsvækkende resultat. Yderligere NUMT'er med lignende fylogenier indikerer, at sådanne hændelser muligvis ikke er unikke.
Et andet problem opstod fra tilstedeværelsen af NUMT i genomet forbundet med vanskelighederne med at afslutte det nøjagtige antal mitokondrielle indsættelser i nDNA. At bestemme det nøjagtige antal NUMT -pseudogener for en art er vanskelig opgave af flere årsager. En grund, der gør detektering af NUMT -sekvenser vanskeligere, er ændringen af disse sekvenser ved mutation og deletion. To yderligere væsentlige forhindringer gør anerkendelse af NUMT meget vanskelig; for det første er den manglende korrelation mellem andelen af ikke -kodende nDNA og antallet af NUMT -indsatser i atomgenomet. Det vil sige, at NUMT -indsættelse kan forekomme i det kendte eller forudsagte kodningsområde, både intron og exon, snarere end kun i intergenisk og intronisk region. For det andet er mitokondrie -DNA, der er integreret i animalsk atomgenom, primært begrænset til dyr med cirkulære mitokondrielle genomer uden introner. NUMT-undersøgelser er ikke tilgængelige hos dyr med lineære mitokondrielle genomer eller dem med intronholdige mitokondrier. På trods af alle de tilgængelige avancerede teknologier er det dog stadig fastslået, om der findes NUMT -transponeringsforskelle mellem cirkulære og lineære mtDNA'er.
Disse vanskeligheder med at opdage tilstedeværelsen af NUMT kan være problematiske. Translokerede mitokondrielle sekvenser i atomgenomet har potentiale til at blive amplificeret ud over eller endda i stedet for den autentiske mål -mtDNA -sekvens, der alvorligt kan forvirre populationsgenetiske og fylogenetiske analyser, da mtDNA har været meget udbredt til befolkningskortlægning, evolutionære og fylogene undersøgelser , artsidentifikation ved hjælp af DNA -stregkode, diagnose af forskellige patologier og retsmedicin. Denne samtidige amplifikation af NUMT med gratis ekstrachromosomalt mtDNA forhindrer derudover en i at bestemme det nøjagtige antal NUMT -fragmenter i genomet af forskellige organismer, såsom Aedes aegypti -myg, især dem, hvor der forekommer udvidet translokation af mtDNA -fragmenter. Dette gør diagnosen af visse mitokondrielle lidelser udfordrende. For eksempel blev der fundet et stort NUMT -pseudogent på kromosom 1, mens nyere analyse af den samme sekvens førte til en konklusion om, at sæd -mtDNA har mutationer, der forårsager lav sædmobilitet. Et andet eksempel ville være den nylige rapport, der beskriver et heteroplasmatisk mtDNA -molekyle, der indeholder fem forbundne missense -mutationer spredt over de sammenhængende mtDNA CO1- og CO2 -gener hos patienter med Alzheimers sygdom , men de nyere undersøgelser, der anvender PCR, restriktionsendonuklease -stedvariantassays og foreslået fylogen analyse at de nukleare CO1- og CO2 -sekvenser afslørede, at de afveg fra moderne humane mtDNA'er tidligt i hominidudviklingen omkring 770.000 år før, og disse bevarede NUMT'er kunne forårsage Alzheimers sygdom. En af de mulige måder at forhindre et sådant fejlagtigt resultat på er en amplifikation og sammenligning af heterogen sekvens, der omfatter både mtDNA og nDNA, med de opnåede resultater fra Sanger -sekventering af renset og beriget mtDNA som vist i figur 4. Selvom denne metode er let og kun få primere er påkrævet, det forhindrer en væsentlig fejl i fylogenetiske undersøgelser af en population og alle de tidligere nævnte falske resultater.
Referencer
Se også
