NUMT - NUMT
NUMT , pronunciado "novo poder", é um acrônimo para " nu clear m i t DNA ochondrial", segmento cunhado pelo geneticista evolucionário Jose V. Lopez , que descreve a transposição de qualquer tipo de DNA mitocondrial citoplasmático para o genoma nuclear de organismos eucarióticos .
Cada vez mais sequências NUMT, com diferentes tamanhos e comprimentos, no diversificado número de eucariotos, têm sido detectadas à medida que mais sequenciamento do genoma completo de diferentes organismos se acumula. Na verdade, os NUMTs são freqüentemente descobertos de forma não intencional por pesquisadores que procuravam o mtDNA ( DNA mitocondrial ). NUMTs foram relatados em todos os eucariotos estudados, e quase todas as regiões do genoma mitocondrial podem ser integradas ao genoma nuclear. No entanto, NUMTs diferem em número e tamanho nas diferentes espécies. Essas diferenças podem ser explicadas pela variação interespecífica em fatores como estabilidade da linha germinativa e número de mitocôndrias. Após a liberação do mtDNA para o citoplasma , devido à alteração mitocondrial e mudanças morfológicas , o mtDNA é transferido para o núcleo por um dos vários métodos previstos e são eventualmente inseridos por processos de reparo de quebra de fita dupla no DNA nuclear (nDNA) . Não só foi encontrada qualquer correlação entre a fração de DNA não codificador e abundância de NUMT no genoma, mas também comprovou que NUMTs têm distribuição não aleatória e uma maior probabilidade de serem inseridos em um determinado local do genoma em comparação com outros. Dependendo da localização da inserção, NUMTs podem perturbar a função dos genes. Além disso, a integração de novo dos pseudogenes NUMT no genoma nuclear tem um efeito adverso em alguns casos, promovendo vários distúrbios e o envelhecimento.
A primeira aplicação do termo NUMT no exemplo do gato doméstico ( Felis catus ) foi surpreendente, uma vez que o número e o conteúdo do gene mitocondrial foram amplificados 38-76X no genoma nuclear do gato, além de serem transpostos do citoplasma. As sequências de cat NUMTs não pareciam ser funcionais devido ao achado de múltiplas mutações, as diferenças nos códigos genéticos mitocondriais e nucleares e a aparente inserção em regiões centrômeras tipicamente inertes. A presença de fragmentos NUMT no genoma não é problemática em todas as espécies; por exemplo, mostra-se que as sequências de origem mitocondrial promovem a replicação do DNA nuclear em Saccharomyces cerevisiae . Embora a translocação estendida de fragmentos de mtDNA e sua co-amplificação com DNA mitocondrial livre tenha sido problemática no diagnóstico de distúrbios mitocondriais, no estudo da genética de populações e análises filogenéticas , os cientistas usaram NUMTs como marcadores genéticos para descobrir o taxa relativa de mutação nuclear e mitocondrial e recriação da árvore evolutiva.
Breve História de NUMT
Pela teoria da endossimbiose , que ganhou aceitação por volta dos anos 1970, a mitocôndria , como uma importante fábrica de energia da célula, era anteriormente um procarioto de vida livre que invadia uma célula eucariótica. Segundo essa teoria, organelas simbióticas transferiram gradualmente seus genes para o genoma eucariótico, o que implica que o mtDNA foi gradualmente integrado ao genoma nuclear. Apesar das alterações metabólicas e adaptações funcionais nos eucariotos hospedeiros, o DNA mitocondrial circular está contido nas organelas. Contendo 37 genes, o DNA mitocondrial tem um papel essencial na produção de compostos necessários, como as enzimas necessárias para o bom funcionamento da mitocôndria. Especificamente, foi sugerido que certos genes (como os genes para as subunidades I e II da citocromo oxidase ) dentro da organela são necessários para regular o equilíbrio redox ao longo das cadeias de transporte de elétrons associadas à membrana. Essas partes do genoma mitocondrial foram relatadas como as mais frequentemente empregadas. A mitocôndria não é o único local dentro do qual o mtDNA da célula, o DNA mitocondrial, pode ser encontrado; às vezes, pode ocorrer a transferência de DNA mitocondrial das organelas para o núcleo; a evidência de tal translocação foi vista através da comparação da sequência do DNA mitocondrial com a sequência do genoma das contrapartes. A integração e recombinação do mtDNA citoplasmático no DNA nuclear é chamada de DNA mitocondrial nuclear, que é abreviado como NUMT. A possível presença de DNA organela dentro do genoma nuclear foi sugerida após a descoberta de estrutura homóloga ao DNA mitocondrial, logo após a descoberta da presença de DNA independente dentro das organelas em 1967. Esse assunto permaneceu intocado até a década de 1980. A evidência inicial de que o DNA poderia se mover entre os compartimentos celulares surgiu quando fragmentos de DNA do cloroplasto foram encontrados no genoma mitocondrial do milho com a ajuda de hibridização cruzada, entre cloroplasto e DNA mitocondrial, e mapeamento físico de regiões homólogas. Após essa observação inicial, Ellis cunhou o nome de "DNA promíscuo" para significar a transferência de DNA intracelularmente de uma organela para outra e é a presença de DNA de organela em múltiplos compartimentos celulares. Esta não é apenas uma descoberta importante por si só, mas também é altamente informativa e útil para compreender o processo evolutivo e o período de tempo em que diferentes ocorrências podem ocorrer. A busca por mtDNA no DNA nuclear continuou até 1994, quando a recente e notável transposição de 7,9 kb de um genoma mitocondrial tipicamente de 17,0 kb para uma posição cromossômica nuclear específica no gato doméstico foi relatada. Esta é a época em que NUMT foi cunhado para designar os grandes trechos de DNA mitocondrial no genoma. Até agora, todos os genomas de muitos eucariotos, tanto vertebrados quanto invertebrados , foram sequenciados e NUMT foi observado no genoma nuclear de vários organismos, incluindo levedura, Podospora , ouriço-do-mar , gafanhoto , abelha melífera, Tribolium , rato, milho , arroz e primatas . Em Plasmodium, Anopheles gambiae e mosquitos Aedes aegypti, NUMT mal pode ser detectado. Em contraste, os fragmentos conservados de NUMT têm agora poucos foram identificados nos dados do genoma de Ciona intestinalis , Neurospora crassa , Schizosaccharomyces pombe , Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster e Rattus norvegicus . Antunes e Ramos encontraram a presença de NUMT no genoma de peixes pela primeira vez em 2005 usando BLAST N, MAFFT , mapeamentos de genoma muito vigoroso e análises filogênicas. Em todo o reino animal, Apis mellifera , do filo Arthropoda , e Hydra magnipapillata , do filo Cnidaria , são respectivamente o primeiro e o segundo animais com a maior proporção de NUMTs para o tamanho total do genoma nuclear, enquanto Monodelphis Domestica ou Gray de cauda curta gambá , é o detentor do recorde de frequência NUMT entre os vertebrados. Semelhante aos animais, os NUMTs são abundantes nas plantas e o fragmento NUMT mais longo conhecido até agora, uma inserção parcialmente duplicada de 620 kb do mtDNA de 367 kb de Arabidopsis thaliana , foi relatada.
Mecanismo de inserção de NUMT
Inserção de NUMT no genoma nuclear e sua persistência no genoma nuclear iniciada pela entrega física de DNA mitocondrial ao núcleo. Esta etapa segue pela integração do mtDNA no genoma por meio de um mecanismo de junção de extremidade não homóloga durante o processo de reparo de quebra de fita dupla (DSB), conforme previsto pelo estudo da levedura de padeiro, Saccharomyces Cerevisiae; e termina por dinâmica intragenômica de amplificação, mutação ou deleção, também conhecida como modificações pós-inserção. O mecanismo de transferência do mtDNA para o núcleo ainda não foi totalmente compreendido.
Transferência do mtDNA liberado para o núcleo: O primeiro passo no processo de transferência é a liberação do mtDNA no citoplasma. Thorsness e Fox demonstraram a taxa de realocação do mtDNA da mitocôndria para o núcleo usando a cepa de levedura ura3 com um plasmídeo URA3 projetado , gene necessário para a biossíntese de uracila, na mitocôndria. Durante a propagação de tais cepas de levedura carregando uma mutação nuclear ura3 , o DNA plasmídeo que escapa da mitocôndria para o núcleo, complementa o defeito biossintético do uracila , restaurando o crescimento na ausência de uracila e o fenótipo facilmente classificado. A taxa de transferência de DNA da mitocôndria para o núcleo foi estimada em 2 x 10-5 por célula por geração, enquanto o oposto, no caso do mutante cox2 , a taxa de transferência do plasmídeo do núcleo para a mitocôndria está aparentemente em pelo menos 100.000 vezes menos. Muitos fatores controlam a taxa de escape do mtDNA da mitocôndria para o núcleo. A maior taxa de mutação no mtDNA em comparação com o nDNA nas células de muitos organismos é um fator importante que promove a transferência de genes mitocondriais para o genoma nuclear. Um dos fatores intergênicos que resulta na maior taxa de destruição de macromoléculas mitocondriais, incluindo mtDNA, é a presença de alto nível de espécies reativas de oxigênio (ROS), geradas nas mitocôndrias como subprodutos no mecanismo de síntese de ATP. Alguns outros fatores que influenciam o escape do mtDNA das mitocôndrias incluem a ação de agentes mutagênicos e outras formas de estresse celular que podem danificar as mitocôndrias ou suas membranas, o que prova ser possível supor que os agentes danosos exógenos (radiação ionizante e agentes químicos genotóxicos) aumentam a taxa de escape do mtDNA para o citoplasma. Thorsness e Fox continuaram suas pesquisas para encontrar os fatores endógenos que afetam o escape do mtDNA para o núcleo. Eles isolaram e estudaram 21 mutantes nucleares com diferentes combinações de mutações em pelo menos 12 loci nucleares chamadas de mutações yme (escape mitocondrial de levedura), em diferentes condições ambientais, uma vez que algumas dessas mutações causam sensibilidade à temperatura. Eles descobriram que essas mutações que perturbam as funções mitocondriais, devido à alteração de produtos gênicos, afetam a integridade mitocondrial e levam ao escape do mtDNA para o citoplasma. Além disso, defeitos nas proteínas alteram a taxa de transferência do mtDNA para o núcleo. Por exemplo, no caso do mutante yme1 , mitocôndrias anormais são direcionadas para degradação pelo vacúolo, com a ajuda de pep4 , uma importante proteinase, e a degradação aumenta o escape de mtDNA para o núcleo através do processo de mitofagia. Além disso, Thorsness e Campbell descobriram que, pela interrupção do pep4 , a frequência de escape do mtDNA nas cepas de yme1 diminui. Da mesma forma, a interrupção do PRC1 , que codifica a carboxipeptidase Y, reduz a taxa de escape do mtDNA na levedura yme1 . As evidências mostram que a mitofagia é uma das formas possíveis de transferência do mtDNA para o núcleo e considerada a via mais suportada até agora. Algumas outras vias possíveis são mostradas na figura 1. A primeira via, como foi explicado, é um mutante yme1 que resulta na inativação da proteína YMe1p , uma metaloproteinase dependente de ATP localizada na mitocôndria , levando a uma alta taxa de escape de mtDNA para o núcleo . As mitocôndrias da cepa yme1 são levadas para degradação pelo vacúolo com mais frequência do que a cepa do tipo selvagem. Além disso, as investigações citológicas sugeriram várias outras vias possíveis em diversas espécies , incluindo uma lise do compartimento mitocondrial, conexão física direta e fusão de membrana entre mitocôndrias e núcleo, e encapsulamento de compartimentos mitocondriais dentro do núcleo, como mostrado na figura 1 .
Preparação pré-inserção: Depois de atingir o núcleo, o mtDNA deve entrar no genoma nuclear. Pode-se esperar que a taxa de incorporação do mtDNA no genoma nuclear dependa do número de DSB no nDNA, da atividade dos sistemas de reparo do DSB e da taxa de escape do mtDNA das organelas. A inserção do MtDNA compreende três processos principais, mostrados na figura 2; primeiro, o mtDNA deve ter a forma e a sequência adequadas; por outras palavras, o mtDNA tem de ser editado, o que dá origem ao novo local editado na estrutura do polinucleótido. O DNA mitocondrial não é universal e, em animais semelhantes a plantas, a edição mitocondrial mostra padrões muito erráticos de ocorrência específica do táxon. Conforme mostrado na figura 2, existem três maneiras possíveis pelas quais o mtDNA pode ser preparado para ser inserido no DNA nuclear. O processo depende principalmente do tempo que o mtDNA é transferido para o núcleo. Conforme mostrado na figura 2b, a integração direta de fragmentos de mtDNA não editados nos genomas nucleares é a mais plausível e as evidências encontradas em plantas, genoma de Arabidopsis e animais com a ajuda de diferentes métodos, incluindo análise baseada em BLAST. Nesse caso, o mtDNA é transferido para o núcleo, por meio do qual a edição e os íntrons surgem posteriormente na mitocôndria. Se um gene, por exemplo, fosse transferido para o núcleo em uma linhagem antes que a edição mitocondrial evoluísse, mas permanecesse na organela em outras linhagens onde a edição surgiu, a cópia nuclear pareceria mais semelhante a uma transcrição editada do que às cópias mitocondriais restantes em os sites editados. Outro modelo representado e menos suportado, figura 2a, é o modelo mediado por cDNA , em que o mtDNA contido no intron entra no núcleo e, por transcrição reversa do transcrito mitocondrial emendado e editado, torna-se integrado no nDNA. O terceiro mecanismo proposto é a transferência direta e integração do mtDNA sem íntron no núcleo, figura 2c, por meio do qual a edição e os íntrons na mitocôndria vêm e vão durante a evolução. Nesse caso, a introdução e a remoção do íntron, bem como a transcrição reversa ocorrem dentro das mitocôndrias e o produto final, o mtDNA sem intron editado, se integrará ao nDNA após ser transferido para o núcleo.
Inserção no genoma nuclear: após o término da etapa preparatória, o mtDNA está pronto para ser inserido no genoma nuclear. Com base no sítio de integração NUMT e nos resultados obtidos analisados do experimento com fermento de padeiro, Blanchard e Schmidt levantaram a hipótese de que o mtDNA é inserido na quebra de fita dupla (DSB) por meio de maquinaria de junção de extremidade não homóloga. A hipótese é amplamente aceita. Análises posteriores foram consistentes com o envolvimento de NHEJ na integração NUMT em humanos. Esses processos ocorrem em células somáticas e germinativas . Em animais e humanos, entretanto, a capacidade de reparo de DSB em células germinativas depende do estágio oogenético e espermatogênico, porém, devido à baixa atividade de reparo, espermatozóides maduros são incapazes de reparo de DSB. Além disso, o DSB também pode ser reparado por recombinação homóloga (HR), que é mais precisa e introduz menos erros no processo de reparo, enquanto, ainda não foi visto no processo de inserção do mtDNA ;. Além do NHEJ canônico, os DSBs são reparados por meio de um mecanismo que envolve sequências contendo alguns nucleotídeos homólogos nas extremidades de um DSB a ser ligado. Este mecanismo é conhecido como união de extremidades mediada por microhomologia abreviada como MMEJ. MMEJ é o mecanismo de reparo DSB mais mutagênico devido à geração de deleções, inserção de vários tamanhos e outros rearranjos do genoma em mamíferos. Como mostrado na figura 3, os processos de inserção de mtDNA e reparo de DSB incluem algumas etapas que são alinhamento do segmento de DNA, processamento final de DNA, síntese de DNA e ligação. Em cada etapa, certos complexos de proteínas são necessários para facilitar a ocorrência dos eventos indicados. Como mostrado na figura 3, em NHEJ, o heterodímero Ku70 / Ku80 e a proteína quinase dependente de DNA (DNA-PK) , para reunir fragmentos de DNA, a nuclease de Artemis e a polinucleotídeo quinase 3 'fosfatase (PNKP) , para o processamento final , Polimerases de DNA da família X (Pol μ e Pol λ) e desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) , para síntese de DNA, e complexo XLF / XRCC4 / LigIV , para completar o reparo e unir as extremidades por meio de uma ligação fosfodiéster, são os complexos de proteínas envolvidos no processo de reparo DSB em muitos organismos superiores. As polimerases de DNA (Pol μ e Pol λ) e o complexo XLF / XRCC4 / LigIV são compartilhados entre duas máquinas de reparo NHEJ e MMEJ e têm a mesma responsabilidade em ambos os processos de reparo. A primeira etapa do MMEJ é realizada pelos complexos de proteínas WRN , Artemis, DNA-PK e XRCC4 que processam as extremidades dos fragmentos de DSB e mtDNA, além de alinhá-los para que as polimerases e ligases sejam capazes de completar a inserção NUMT (figura 3 )
Modificação pós-inserção: O padrão complexo de NUMT em comparação com a única peça mitocondrial, o aparecimento de DNA mitocondrial não contínuo no genoma nuclear e, possivelmente, orientação diferente desses fragmentos são evidências de processos pós-inserção de NUMT dentro o genoma nuclear. A causa desses padrões complexos pode ser o resultado de várias inserções NUMT em pontos de acesso de inserção. Além disso, a duplicação após a inserção contribui para a diversidade de NUMT. NUMTs não têm mecanismo autorreplicante ou mecanismo de transposição; portanto, espera-se que a duplicação NUMT ocorra em tandem ou envolva uma duplicação segmentar maior em taxas representativas do resto do genoma. A evidência de duplicações NUMT que não estão próximas a outros NUMTs está presente em muitos genomas e provavelmente acontece como parte da duplicação segmentar. No entanto, as duplicações de NUMTs específicas de humanos recentes como parte da duplicação segmentar parecem ser raras; em humanos, apenas alguns NUMTs foram encontrados com sobreposição com a duplicação segmentar, e esses NUMTs foram encontrados em apenas uma das cópias enquanto estavam ausentes nas outras, demonstrando claramente que os NUMTs foram inseridos após os eventos de duplicação. A exclusão é outro método NUMT de modificação pós-inserção que ainda não foi estudado com a mesma quantidade de detalhes de uma inserção. A erosão constante dos sinais filogênicos e a alta taxa de mutação no mtDNA animal tornam o reconhecimento de tal modificação, especialmente a deleção, difícil. O estudo dos casos em que o padrão de presença-ausência de NUMTs não condiz com a árvore filogenética deve possibilitar a detecção de perdas recentes de NUMT por meio do uso de múltiplos alinhamentos de genoma com a presença de um grupo externo. Bensasson e os membros de sua equipe usaram esse método para estimar o NUMT mais antigo inserido em humanos, que datava de cerca de 58 milhões de anos atrás.
Características gerais de NUMT
Como o número de mitocôndrias e seu nível funcional difere entre os organismos eucarióticos, o comprimento, a estrutura e a sequência dos NUMTs variam dramaticamente. Os pesquisadores descobriram que as inserções NUMT recentes são derivadas de diferentes segmentos do genoma mitocondrial, incluindo o D-loop e, em alguns casos extremos, uma série de, quase, o genoma mitocondrial de comprimento total. A sequência, frequência, distribuição de tamanho e até mesmo as dificuldades de encontrar essas sequências no genoma variam substancialmente entre as espécies. A maioria dos fragmentos de DNA transferidos de mitocôndrias e plastídios para o genoma nuclear têm menos de 1 kb de tamanho. No entanto, fragmentos extremamente grandes de DNA de organela são encontrados em alguns genomas de plantas.
À medida que o genoma evolui e se altera ao longo do tempo por mutação, o número de NUMT no genoma difere ao longo da evolução. NUMT entra no núcleo e se insere no nDNA em diferentes estágios do tempo. Devido à constante mutação e instabilidade de NUMT, a semelhança deste trecho do genoma com o mtDNA varia amplamente em todo o reino Animalia e até mesmo dentro de um determinado genoma. Por exemplo, o último número de NUMT registrado no genoma humano é de 755 fragmentos que variam de 39 bp a quase toda a sequência mitocondrial em tamanho. Existem 33 sequências parálogas com mais de 80% de similaridade de sequência e de comprimento maior que 500 bp. Além disso, nem todos os fragmentos NUMT no genoma são o resultado da migração do mtDNA; alguns são o resultado da amplificação após a inserção. Descobriu-se que os NUMTs antigos são mais abundantes no genoma humano do que os integrantes recentes, indicando que o mtDNA pode ser amplificado uma vez inserido. Dayama et al. desenvolveu uma nova técnica de alto rendimento para a detecção exata do número de NUMT no genoma humano, chamada dinumt . Este método permite que ela e os membros de sua equipe identifiquem inserções NUMT, de todos os tamanhos, em todos os genomas sequenciados usando a tecnologia de sequenciamento emparelhada com maior sensibilidade. Eles aplicaram dinumt a 999 indivíduos do Projeto 1000 Genomes e Projeto de Diversidade do Genoma Humano (HGDP) e conduziram uma análise de enriquecimento atualizada em humanos usando essas inserções polimórficas . Uma investigação mais aprofundada e genotipagem do NUMT descoberto também analisa a idade de inserção, origem e características de sequência. Finalmente, eles avaliaram seu impacto potencial em estudos em andamento de heteroplasmia mitocondrial.
Como mencionado anteriormente, o mtDNA é inserido no genoma nuclear apenas quando um DSB é produzido por fatores de dano endógenos ou exógenos. No entanto, o mtDNA não é inserido em nenhum local do genoma. Além disso, não há correlação entre a fração de DNA não codificador e a abundância de NUMT; Além disso, Antunes e Ramos descobriram que NUMTs antigos são inseridos preferencialmente nos loci conhecidos e previstos, como inferido para NUMTs recentes no genoma humano, durante seu trabalho vigoroso na sequência NUMT em peixes usando o método de análise BLASTN. Portanto, com base nesses estudos, a inserção de NUMT no genoma nuclear é considerada não aleatória. Um dos melhores estudos que comprovam a distribuição não aleatória e a inserção de NUMTs no genoma nuclear é feito por Tsuji e seus companheiros de equipe. Usando o método LAST em vez de BLAST, que torna possível calcular o valor E com maior precisão e não sub-representa os elementos repetitivos nos flancos NUMT, Tsuji e seu companheiro de equipe tornaram-se capazes de caracterizar a localização da inserção de NUMT com precisão. Eles descobriram que os fragmentos NUMT tendem a ser inseridos em regiões com alta curvatura local de DNA ou dobrabilidade e oligômeros ricos em A + T, especialmente TAT. Além disso, NUMTs são principalmente inseridos em regiões abertas da cromatina. Usando o mesmo método, Tsuji mostrou que os NUMTs não são geralmente agrupados e os NUMTs produzidos pelo D-loop são geralmente sub-representados, o que é mais evidente em macacos e humanos em comparação com ratos e camundongos devido ao comprimento total de seus NUMTs. No entanto, Tsuji também descobriu que a estrutura do retrotransposon é altamente enriquecida nos flancos NUMT e a maioria dos NUMTs são inseridos nas proximidades do retrotransposon enquanto apenas alguns, 10 de 557 NUMTs, foram inseridos dentro de um retrotransposon, eles não puderam encontrar qualquer relação clara do tamanho de DNA não codificante e o número de NUMT.
Consequências da integração De Novo de NUMT inserções
NUMTs não são totalmente sem função e certas funções estão sendo associadas a eles. Embora a inserção de NUMTs fosse anteriormente considerada pseudogenes sem função, NUMTs humanos recentes são mostrados como um processo potencialmente mutagênico que pode danificar a integridade funcional do genoma humano. O acúmulo de mutação em NUMT, alteração pós-inserção, mecanismo mutagênico de inserção NUMT, MMEJ e NHEJ, DSB, bem como o local em que o ponto quente de inserção está localizado pode causar mutação e alterações dramáticas da estrutura do genoma no sítio de integração , interferem na função do genoma e exercem efeitos substanciais na expressão da informação genética. Além disso, a integração de sequências de mtDNA afeta substancialmente a organização espacial do nDNA e pode desempenhar um papel importante na evolução de genomas eucarióticos. Além do efeito negativo do mtDNA, aqueles NUMTs antigos conservados no genoma provavelmente representam sucessos evolutivos e devem ser considerados como um mecanismo evolutivo potencial para o aumento das regiões codificantes do genoma. Além disso, Chatre e Ricchetti com a utilização de eletroforese bidimensional em gel , construção de plasmídeo , mutagênese , em uma análise sillico de motivos ACS e ensaio de taxa de perda de plasmídeo descobriram que DNAs mitocondriais migratórios podem impactar a replicação da região nuclear em que estão inserido. Por meio de suas evidências funcionais, eles mostraram que as sequências de origem mitocondrial promovem a replicação do nDNA em Saccharomyces cerevisiae . NUMTs são ricos 11-bp ARS core-A sequência consenso (ACS), cuja presença nas correspondências a esses motivos de consenso, na origem de replicação de Saccharomyces cerevisiae , é necessária, mas não suficiente para a função de origem de replicação e qualquer mutação em este consenso causa a redução ou perda da atividade de replicação do DNA. Dada a alta densidade de motivos ACS, alguns NUMTs aparecem essencialmente como portadores ACS. Em contraste, a eficiência de replicação é maior nas cepas de levedura que possuem plasmídeos contendo NUMT e ARS. Eles também descobriram que alguns NUMTs podem funcionar como uma bifurcação de replicação independente e origens cromossômicas tardias e NUMTs localizados próximos ou dentro do ARS fornecem elementos de sequência chave para replicação. Assim, NUMTs podem atuar como origens independentes, quando inseridos em um contexto genômico apropriado ou afetar a eficiência de origens pré-existentes.
Doenças e distúrbios: a inserção de NUMT no genoma pode ser problemática. A transposição de NUMTs para o genoma também foi associada a doenças humanas. A integração de novo dos pseudogenes NUMT no genoma nuclear tem um efeito adverso em alguns casos, promovendo vários distúrbios e o envelhecimento. A integração do MtDNA em genes codificadores nas células germinativas tem consequências dramáticas para o desenvolvimento do embrião e, em muitos casos, é letal. Poucos pseudogenes NUMT associados a doenças são encontrados dentro dos exons ou nas fronteiras exon-intron dos genes humanos. Por exemplo, os pacientes com síndrome da mucolipidose herdam uma mutação causada pela inserção de um fragmento de 93 pb de ND5 mitocondrial no exon 2 do gene da mucolipina R403C. Este é o primeiro caso de distúrbio hereditário devido ao encarte NUMT. Apesar do pequeno grupo de tratamento, o transplante de células-tronco demonstrou ser eficaz e os níveis de enzimas lisossomais pareciam normalizar após o transplante em pelo menos um caso. A síndrome de Pallister-Hall , um distúrbio do desenvolvimento, em outro exemplo, em que um distúrbio funcional de um gene importante do desenvolvimento resulta de uma inserção de novo de um fragmento de mtDNA de 72 pb no exon 14 de GLI3 no cromossomo 7 , que resulta em polidactilia central e pós-axial , epiglote bífida, ânus imperfurado, anormalidades renais, incluindo malformações císticas, hipoplasia renal , implantação ureteral ectópica e anomalias de segmentação pulmonar , como pulmões bilobados bilateralmente. Uma mutação no local de splice no gene humano para o fator VII do plasma que causa deficiência grave do fator VII do plasma, doença hemorrágica, resulta de uma inserção NUMT de 251 pb. Como último exemplo conhecido, uma inserção de 36 pb no exon 9 do gene USH1C associado à síndrome de Usher tipo IC é o NUMT. Ainda não foi encontrada nenhuma maldição para a síndrome de Usher , no entanto, um estudo clínico atual em 18 voluntários está ocorrendo para determinar a influência do UshStat em um período de curto e longo prazo. Este estudo foi iniciado em setembro de 2013 e a estimativa é que seja feito até outubro de 2023.
Envelhecimento: Vários estudos indicaram que o aparecimento de novo de pseudogenes NUMT no genoma das células somáticas pode ser de importância etiológica para a carcinogênese e o envelhecimento. Para mostrar a relação entre envelhecimento e NUMT no genoma nuclear, Cheng e Ivessa usaram cepas mutantes yme1-1 de Saccharomyces Cerevisiae que têm uma taxa mais alta de migração de mtDNA. O método é exatamente o mesmo que Thorsness e Fox usaram para determinar os mecanismos e fatores importantes para a migração do mtDNA para o núcleo. Eles descobriram que as cepas de levedura com taxas de migração elevadas de fragmentos de mtDNA para o núcleo mostraram envelhecimento cronológico acelerado, enquanto as cepas com taxas de transferência de mtDNA diminuídas para o núcleo exibiram um CLS estendido, tempo de vida cronológico que poderia ser devido ao efeito de NUMT em processos nucleares incluindo replicação, recombinação e reparo de DNA, bem como transcrição de genes. O efeito do NUMT nos organismos eucarióticos superiores foi investigado por Caro e seus companheiros de equipe nos ratos como organismo modelo. Usando uma quantificação de PCR em tempo real, hibridização in situ de mtDNA para nDNA e comparação de ratos jovens e velhos, Caro e sua equipe não só puderam determinar a alta concentração de citocromo oxidase III e 16S rRNA do mtDNA em ratos jovens e velhos , mas também poderiam descobrir o aumento no número de sequências mitocondriais no nDNA à medida que o rato envelhece. Assim, com base nesses achados, as mitocôndrias podem ser um dos principais desencadeadores do envelhecimento, mas o alvo final também pode ser o núcleo.
Câncer: O impacto mais terrível da inserção de NUMT acontece quando o mtDNA é inserido na região reguladora ou genes estruturais nucleares e interrompe ou altera os processos celulares vitais. Por exemplo, em neoplasias cerebrais primárias de baixo grau, a análise de hibridização fluorescente in situ ajudou no reconhecimento de mtDNA localizado no núcleo em correlação com um aumento geral no conteúdo de mtDNA na célula. Este evento ontogenicamente precoce é importante na etiologia desses tumores. Da mesma forma, em células de hepatoma , as sequências de mtDNA estão presentes no genoma nuclear em um número de cópias mais alto, em contraste com os tecidos normais. Outro exemplo seria HeLa nDNA que contém sequências que hibridizam com fragmentos de mtDNA de aproximadamente 5 kb. Uma análise mostrou que o nDNA de células malignas contém sequências dos genes mitocondrial citocromo oxidase I , ND4 , ND4L e 12S rRNA. Com base nessas descobertas, os fragmentos de mtDNA foram considerados como um elemento genético móvel no início da carcinogênese . Southern blotting é o método usado para determinar a frequência de inserção mitocondrial em nDNA de células normais e tumorais de camundongos e ratos, o que provou que as sequências de mtDNA são muito mais numerosas e abundantes em nDNA de células tumorais de roedores em comparação com células normais . Usando sondas FISH, PCR e sequenciamento de dados, mapeamento e comparação, Ju e seu colega descobriram que as fusões do genoma mitocondrial-nuclear ocorrem em uma taxa semelhante por par de base de DNA como rearranjos nucleares intercromossômicos, indicando a presença de uma alta frequência de contato entre DNA mitocondrial e nuclear em algumas células somáticas. Além disso, Ju e seus companheiros investigaram o momento da integração do mtDNA somático no genoma nuclear, avaliando casos em que uma amostra metastática havia sido sequenciada além do tumor primário. Em alguns casos, as transferências de mtDNA para o núcleo em células somáticas são muito frequentes e podem ocorrer após a formação neoplásica e durante o curso da evolução subclonal do câncer, o que sugere que esse evento ocorre nos clones de câncer ancestral comum ou em células somáticas normais antes do mudança neoplásica. Esses achados demonstraram a presença de correlação direta entre o NUMT e o câncer em diferentes órgãos do corpo. Compreender a relação, o momento da inserção do NUMT, a localização da inserção e os genes interrompidos ajudaria na produção de um medicamento mais poderoso e eficaz.
Usos experimentais e erros
Embora compreender a inserção não aleatória de NUMT e realizar determinada função após a inserção, ajude a revelar a estrutura e determinar a função completa do genoma, especialmente o genoma humano, NUMTs têm sido usados como ferramentas experimentais e têm sido benéficos em diferentes campos biológicos até antes de ter qualquer conhecimento sobre a função dos NUMTs. Por exemplo, NUMTs podem ser usados não apenas como marcadores genéticos, mas também como uma ferramenta para entender a taxa relativa de mutação no núcleo e nas mitocôndrias, bem como para recriar árvores evolutivas. O processo contínuo de integração de NUMT no genoma nuclear é evidenciado pela descoberta de NUMTs que foram inseridos no genoma humano após a divergência humano-chimpanzé. Alguns desses NUMTs são variáveis quanto à presença ou ausência genômica, indicando que surgiram recentemente na população humana, permitindo que sejam usados como marcadores genéticos de linhagem. Usando um protocolo baseado no alinhamento do genoma para estimar o número de NUMT em espécies intimamente relacionadas, Hazkani-Covo e Graur não só puderam identificar eventos evolutivos que podem ter afetado a composição de NUMT em cada genoma, mas também reconstruir a composição de NUMT no ancestral comum de humano e chimpanzé. Os NUMTs também podem ser usados para comparar a taxa de evolução da sequência nuclear não funcional com a do mtDNA funcional e determinar a taxa de evolução pela taxa de acúmulo de mutação ao longo das sequências NUMT ao longo do tempo. As regiões menos restritas seletivamente são os segmentos com maior divergência da sequência mitocondrial. Uma das aplicações mais promissoras do estudo NUMT é seu uso no estudo de mutação nuclear. Em metazoários , NUMTs são considerados não funcionais. Portanto, as mutações nucleares podem ser distinguidas das alterações mitocondriais e o estudo da substituição, inserção e deleção de nucleotídeos seria possível. Além disso, a homologia de sequências NUMT parálogas com o mtDNA permite testar os efeitos da sequência local na mutação. Todas essas informações obtidas a partir do estudo dos fragmentos NUMT poderiam ser usadas para entender a evolução mitocondrial, bem como os processos evolutivos ao longo da história.
NUMTs oferecem uma oportunidade de estudar a diversidade antiga de linhagens mitocondriais e descobrir a hibridização interespécies pré-histórica. A hibridização antiga foi detectada pela primeira vez (usando NUMTs) em cerdas, depois em macacos colobine e, mais recentemente, em um ancestral humano direto. A hibridização hominídea aconteceu na época da separação humano / chimpanzé / gorila . Este último estudo diz respeito a um NUMT humano compartilhado com chimpanzés e gorilas. A filogenia conjunta das três sequências NUMT e dos genomas mitocondriais de grandes macacos implica que um ancestral comum dos três NUMTs foi transferido para a linhagem humana / chimpanzé / gorila de uma espécie de hominídeo separada deles por cerca de 4,5 milhões de anos de evolução do mtDNA. Embora a hibridização dessa magnitude não seja inédita entre os primatas, sua ocorrência na linhagem humana direta, em torno da época crítica da especiação humano / macaco, é um resultado surpreendente. NUMTs adicionais com filogenias semelhantes indicam que tais eventos podem não ser únicos.
Outro problema surgiu da presença de NUMT no genoma associado à dificuldade de concluir o número exato de inserções mitocondriais no nDNA. Determinar o número exato de NUMT pseudogenes para uma espécie é uma tarefa difícil por várias razões. Uma razão que torna a detecção de sequências NUMT mais difícil é a alteração dessas sequências por mutação e deleção. Dois outros obstáculos substanciais tornam o reconhecimento do NUMT muito difícil; primeiro é a falta de correlação entre a proporção de nDNA não codificante e o número de inserções NUMT no genoma nuclear. Ou seja, a inserção de NUMT pode ocorrer na região de codificação conhecida ou prevista, tanto o íntron quanto o exon, em vez de apenas na região intergênica e intrônica. Em segundo lugar, o DNA mitocondrial integrado em genomas nucleares de animais é principalmente limitado a animais com genomas mitocondriais circulares sem íntrons. Os estudos NUMT não estão disponíveis em animais com genomas mitocondriais lineares ou naqueles com mitocôndrias contendo intrões. Portanto, apesar de todas as tecnologias avançadas disponíveis, permanece para ser determinado se existem diferenças de transposição NUMT entre mtDNAs circulares e lineares.
Essas dificuldades para detectar a presença de NUMT podem ser problemáticas. Sequências mitocondriais translocadas no genoma nuclear têm o potencial de serem amplificadas além de, ou mesmo em vez da sequência de mtDNA alvo autêntica, que pode confundir seriamente as análises genéticas e filogenéticas populacionais, uma vez que o mtDNA tem sido amplamente utilizado para mapeamento populacional, estudos evolutivos e filogênicos , identificação de espécies por código de barras de DNA, diagnóstico de várias patologias e medicina legal. Essa amplificação simultânea de NUMT com mtDNA extracromossômico livre, adicionalmente, impede que se determine o número exato de fragmentos NUMT no genoma de diferentes organismos, como os mosquitos Aedes aegypti , especialmente aqueles nos quais ocorre translocação estendida de fragmentos de mtDNA. Isso torna o diagnóstico de certas doenças mitocondriais um desafio. Por exemplo, um grande pseudogene NUMT foi encontrado no cromossomo 1, enquanto uma análise mais recente da mesma sequência levou à conclusão de que o mtDNA do espermatozóide tem mutações que causam baixa mobilidade do esperma. Outro exemplo seria o relatório recente que descreve uma molécula de mtDNA heteroplasmática contendo cinco mutações missense ligadas dispersas sobre os genes mtDNA CO1 e CO2 contíguos em pacientes com doença de Alzheimer ; que as sequências nucleares de CO1 e CO2 revelaram que divergiram dos modernos mtDNAs humanos no início da evolução dos hominídeos, cerca de 770.000 anos antes, e que esses NUMTs preservados poderiam causar a doença de Alzheimer. Uma das formas possíveis de prevenir tal resultado errôneo é uma amplificação e comparação de sequência heterogênea, compreende tanto mtDNA quanto nDNA, com os resultados obtidos a partir do sequenciamento Sanger de mtDNA purificado e enriquecido conforme mostrado na figura 4. Embora este método seja fácil e apenas alguns primers são necessários, isso evitará um erro substancial nos estudos filogenéticos de uma população e todos os resultados falsos mencionados anteriormente.
Referências
Veja também
