NUMT - NUMT
NUMT , pronunciado "nueva fuerza", es un acrónimo de " nu claro m i t ochondrial ADN" segmento acuñado por genetista evolutivo, Jose V. Lopez , que describe una transposición de cualquier tipo de ADN mitocondrial citoplasmática en el genoma nuclear de eucariotas organismos .
Se han detectado cada vez más secuencias NUMT, con diferentes tamaños y longitudes, en el diverso número de eucariotas, a medida que se acumulan más secuencias genómicas completas de diferentes organismos . De hecho, los NUMT a menudo han sido descubiertos involuntariamente por investigadores que buscaban ADNmt ( ADN mitocondrial ). Se han informado NUMT en todos los eucariotas estudiados, y casi todas las regiones del genoma mitocondrial pueden integrarse en el genoma nuclear. Sin embargo, los NUMT difieren en número y tamaño entre diferentes especies. Estas diferencias pueden explicarse por variaciones interespecíficas en factores como la estabilidad de la línea germinal y el número de mitocondrias. Después de la liberación del mtDNA al citoplasma , debido a la alteración mitocondrial y los cambios morfológicos , el mtDNA se transfiere al núcleo mediante uno de los diversos métodos predichos y finalmente se inserta mediante procesos de reparación de rotura de doble hebra en el ADN nuclear (nDNA). . No solo se ha encontrado alguna correlación entre la fracción de ADN no codificante y la abundancia de NUMT en el genoma, sino que también se ha demostrado que las NUMT tienen una distribución no aleatoria y una mayor probabilidad de insertarse en una determinada ubicación del genoma en comparación con otras. Dependiendo de la ubicación de la inserción, los NUMT pueden alterar la función de los genes. Además, la integración de novo de los pseudogenes NUMT en el genoma nuclear tiene un efecto adverso en algunos casos, promoviendo diversos trastornos y el envejecimiento.
La primera aplicación del término NUMT en el ejemplo del gato doméstico ( Felis catus ) fue llamativa, ya que el número y el contenido de genes mitocondriales se amplificaron 38-76X en el genoma nuclear del gato, además de transponerse desde el citoplasma. Las secuencias de cat NUMT no parecían ser funcionales debido al hallazgo de múltiples mutaciones, las diferencias en los códigos genéticos mitocondriales y nucleares y la aparente inserción dentro de regiones típicamente inertes del centrómero. La presencia de fragmentos NUMT en el genoma no es problemática en todas las especies; por ejemplo, se muestra que las secuencias de origen mitocondrial promueven la replicación del ADN nuclear en Saccharomyces cerevisiae . Aunque la translocación extendida de fragmentos de ADNmt y su coamplificación con ADN mitocondrial libre ha sido problemática en el diagnóstico de trastornos mitocondriales, en el estudio de la genética de poblaciones y los análisis filogenéticos , los científicos han utilizado NUMT como marcadores genéticos para averiguar la tasa relativa de mutación nuclear y mitocondrial y recreación del árbol evolutivo.
Breve historia de NUMT
Por la teoría de la endosimbiosis , que ganó aceptación en todo el decenio de 1970, la mitocondria , como una fábrica importante de energía de la célula, antes era un procariota de vida libre que invadió una célula eucariota. Según esta teoría, los orgánulos simbióticos transfirieron gradualmente sus genes al genoma eucariota, lo que implica que el ADNmt se integró gradualmente en el genoma nuclear. A pesar de las alteraciones metabólicas y las adaptaciones funcionales en los eucariotas del huésped, los orgánulos contienen ADN mitocondrial circular. El ADN mitocondrial, que contiene 37 genes, tiene un papel esencial en la producción de los compuestos necesarios, como las enzimas necesarias para el correcto funcionamiento de las mitocondrias. Específicamente, se ha sugerido que ciertos genes (como los genes de las subunidades I y II de la citocromo oxidasa ) dentro del orgánulo son necesarios para regular el equilibrio redox a lo largo de las cadenas de transporte de electrones asociadas a la membrana. Se ha informado que estas partes del genoma mitocondrial son las más empleadas. Las mitocondrias no es el único lugar en el que se puede encontrar el ADNmt celular, el ADN mitocondrial; a veces puede ocurrir la transferencia de ADN mitocondrial de los orgánulos al núcleo; la evidencia de tal translocación se ha visto a través de la comparación de la secuencia del ADN mitocondrial con la secuencia del genoma de las contrapartes. La integración y recombinación del ADNmt citoplásmico en el ADN nuclear se denomina ADN mitocondrial nuclear, que se abrevia como NUMT. La posible presencia de ADN de orgánulos dentro del genoma nuclear se sugirió después del hallazgo de una estructura homóloga al ADN mitocondrial, que fue poco después del descubrimiento de la presencia de un ADN independiente dentro de los orgánulos en 1967. Este tema permaneció intacto hasta la década de 1980. La evidencia inicial de que el ADN podía moverse entre los compartimentos celulares se produjo cuando se encontraron fragmentos de ADN de cloroplasto en el genoma mitocondrial del maíz con la ayuda de la hibridación cruzada, entre el ADN de cloroplasto y mitocondrial, y el mapeo físico de regiones homólogas. Después de esta observación inicial, Ellis acuñó el nombre "DNA promiscuo" para significar la transferencia de ADN intracelularmente de un orgánulo a la otra y es la presencia de ADN de orgánulo en múltiples compartimentos celulares. Este no solo es un descubrimiento importante en sí mismo, sino que también es muy informativo y útil para comprender el proceso evolutivo y el período de tiempo en que pueden ocurrir diferentes eventos. La búsqueda de ADNmt en el ADN nuclear continuó hasta 1994 cuando la reciente notable transposición se informó de 7,9 kb de un típicamente 17,0 kb mitocondrial genoma a una posición cromosómica nuclear específico en el gato doméstico. Este es el momento en que se acuñó NUMT para designar los grandes tramos de ADN mitocondrial en el genoma. Hasta ahora, se han secuenciado todos los genomas de muchos eucariotas, tanto de vertebrados como de invertebrados , y se ha observado NUMT en el genoma nuclear de varios organismos, incluyendo levadura, Podospora , erizo de mar , langosta , abeja melífera, Tribolium , rata, maíz. , arroz y primates . En Plasmodium, Anopheles gambiae y Aedes aegypti, los mosquitos NUMT apenas pueden detectarse. Por el contrario, los fragmentos conservados de NUMT ahora se han identificado pocos en los datos del genoma de Ciona intestinalis , Neurospora crassa , Schizosaccharomyces pombe , Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster y Rattus norvegicus . Antunes y Ramos encontraron la presencia de NUMT en el genoma de los peces por primera vez en 2005 utilizando BLAST N, MAFFT , mapeos genómicos muy vigorosos y análisis filogenéticos. En todo el reino animal, Apis mellifera , del phylum Arthropoda , e Hydra magnipapillata , del phylum Cnidaria , son, respectivamente, el primer y segundo animales con la proporción más alta de NUMT con respecto al tamaño total del genoma nuclear, mientras que Monodelphis Domestica o Gray de cola corta. zarigüeya , es el poseedor del récord de frecuencia NUMT entre los vertebrados. Al igual que en los animales, los NUMT son abundantes en las plantas y se informó del fragmento NUMT más largo conocido hasta ahora, una inserción parcialmente duplicada de 620 kb del ADNmt de 367 kb de Arabidopsis thaliana .
Mecanismo de inserción NUMT
Inserción de NUMT en el genoma nuclear y su persistencia en el genoma nuclear iniciada por la entrega física de ADN mitocondrial al núcleo. Este paso sigue por la integración en el genoma de ADNmt a través de un extremo no homóloga unirse mecanismo durante rotura de doble hebra proceso de reparación (DSB) como se prevé mediante el estudio de la levadura de panadero, Saccharomyces cerevisiae; y termina por dinámica intragenómica de amplificación, mutación o deleción, que también se conoce como modificaciones posteriores a la inserción. El mecanismo de transferencia del mtDNA al núcleo aún no se ha entendido completamente.
Transferencia del mtDNA liberado al núcleo: el primer paso en el proceso de transferencia es la liberación de mtDNA al citoplasma. Thorsness y Fox demostraron la tasa de reubicación del mtDNA de las mitocondrias al núcleo usando cepa de levadura ura3- con un plásmido URA3 diseñado , gen requerido para la biosíntesis de uracilo, en las mitocondrias. Durante la propagación de tales cepas de levadura que portan una mutación nuclear de ura3 , el ADN plasmídico que escapa de la mitocondria al núcleo complementa el defecto biosintético del uracilo , restaurando el crecimiento en ausencia de uracilo y puntuando fácilmente el fenotipo. La tasa de transferencia de ADN de las mitocondrias al núcleo se estimó en 2 x 10-5 por célula por generación, mientras que al contrario, en el caso del mutante cox2 , la tasa de transferencia de plásmido desde el núcleo a las mitocondrias es aparentemente de menos 100.000 veces menos. Muchos factores controlan la tasa de escape de mtDNA de las mitocondrias al núcleo. La mayor tasa de mutación en el mtDNA en comparación con el nDNA en las células de muchos organismos es un factor importante que promueve la transferencia de genes mitocondriales al genoma nuclear. Uno de los factores intergénicos da como resultado la mayor tasa de destrucción de las macromoléculas mitocondriales, incluido el ADNmt, es la presencia de un alto nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS), generadas en las mitocondrias como subproductos del mecanismo de síntesis de ATP. Algunos otros factores que influyen en el escape del mtDNA de las mitocondrias incluyen la acción de agentes mutagénicos y otras formas de estrés celular que pueden dañar las mitocondrias o sus membranas, lo que demuestra que es posible asumir que los agentes dañinos exógenos (radiaciones ionizantes y agentes químicos genotóxicos) aumentan la tasa de escape de ADNmt hacia el citoplasma. Thorsness y Fox continuaron su investigación para encontrar los factores endógenos que afectan el escape del ADNmt hacia el núcleo. Aislaron y estudiaron 21 mutantes nucleares con diferentes combinaciones de mutaciones en al menos 12 loci nucleares llamados mutaciones yme (escape mitocondrial de levadura), en diferentes condiciones ambientales, ya que algunas de estas mutaciones causan sensibilidad a la temperatura. Descubrieron estas mutaciones que perturban las funciones mitocondriales, debido a la alteración de los productos génicos, afectan la integridad mitocondrial y conducen al escape del mtDNA al citoplasma. Además, los defectos en las proteínas cambian la tasa de transferencia del mtDNA al núcleo. Por ejemplo, en el caso del mutante yme1 , las mitocondrias anormales son objeto de degradación por la vacuola, con la ayuda de pep4 , una proteinasa principal, y la degradación aumenta el escape del mtDNA al núcleo a través del proceso de mitofagia. Además, Thorsness y Campbell encontraron que al interrumpir pep4 , la frecuencia de escape del mtDNA en las cepas yme1 disminuye. De manera similar, la alteración de PRC1 , que codifica la carboxipeptidasa Y, reduce la tasa de escape del ADNmt en la levadura yme1 . La evidencia muestra que la mitofagia es una de las posibles formas de transferencia de mtDNA al núcleo y se ha determinado que es la vía con mayor apoyo hasta ahora. Algunas otras posibles vías se muestran en la figura 1. La primera vía, como se explicó, es un mutante yme1 que da como resultado la inactivación de la proteína YMe1p , una metaloproteinasa dependiente de ATP localizada en las mitocondrias , que conduce a una alta tasa de escape de mtDNA al núcleo. . Las mitocondrias de la cepa yme1 son absorbidas por la vacuola para su degradación con más frecuencia que la cepa de tipo salvaje. Además, las investigaciones citológicas han sugerido varias otras posibles vías en el diverso número de especies , incluida la lisis del compartimento mitocondrial, la conexión física directa y la fusión de membranas entre las mitocondrias y el núcleo, y la encapsulación de los compartimentos mitocondriales dentro del núcleo, como se muestra en la figura 1. .
Preparación previa a la inserción: después de llegar al núcleo, el ADNmt debe ingresar al genoma nuclear. La tasa de ADNmt incorporación en el genoma nuclear se puede esperar que dependerá del número OSD a ADNn, la actividad de los sistemas de reparación de DSB, y la tasa de ADNmt escape de orgánulos. La inserción de ADNmt comprende tres procesos principales, que se muestran en la figura 2; primero, el mtDNA debe tener la forma y secuencia adecuadas; en otras palabras, el mtDNA debe editarse, lo que da lugar al nuevo sitio editado en la estructura del polinucleótido. El ADN mitocondrial no es universal y, en animales similares a las plantas, la edición mitocondrial muestra patrones muy erráticos de ocurrencia específica de taxón. Como se muestra en la figura 2, hay tres formas posibles en las que el ADNmt puede prepararse para insertarse en el ADN nuclear. El proceso depende principalmente del tiempo en que el mtDNA se transfiere al núcleo. Como se muestra en la figura 2b, la integración directa de fragmentos de ADNmt sin editar en los genomas nucleares es la más plausible y la evidencia se encuentra en plantas, genoma de Arabidopsis y animales con la ayuda de diferentes métodos, incluido el análisis basado en BLAST. En este caso, el mtDNA se transfiere al núcleo por lo que la edición y los intrones surgen en la mitocondria más tarde. Si un gen, por ejemplo, se transfirió al núcleo en un linaje antes de que evolucionara la edición mitocondrial, pero permaneciera en el orgánulo en otros linajes donde surgió la edición, la copia nuclear parecería más similar a una transcripción editada que a las copias mitocondriales restantes en los sitios editados. Otro modelo representado y menos respaldado, la figura 2a, es el modelo mediado por ADNc , cuyo ADNmt contenido en intrones ingresa al núcleo y, mediante la transcripción inversa de la transcripción mitocondrial empalmada y editada, se integra en el ADNn. El tercer mecanismo propuesto es la transferencia e integración directa de ADNmt sin intrones en el núcleo, figura 2c, mediante el cual la edición y los intrones en la mitocondria van y vienen durante la evolución. En este caso, la introducción y la eliminación del intrón, así como, la transcripción inversa se producen dentro de la mitocondria y el producto final, el editado intronless ADNmt, integrará en nDNA después de ser transferido en el núcleo.
Inserción en el genoma nuclear: una vez finalizado el paso preparatorio, el ADNmt está listo para insertarse en el genoma nuclear. Basándose en el sitio de integración NUMT y los resultados obtenidos analizados del experimento de levadura de panadería, Blanchard y Schmidt plantearon la hipótesis de que el ADNmt se inserta en la rotura de doble hebra (DSB) a través de una maquinaria de unión de extremos no homóloga. Se encuentra que la hipótesis es ampliamente aceptada. Los análisis posteriores fueron consistentes con la participación de NHEJ en la integración de NUMT en humanos. Estos procesos ocurren tanto en las células somáticas como en las de la línea germinal . En los animales y los seres humanos, sin embargo, la capacidad de reparación de DSB en células de la línea germinal depende de la etapa oogenetic y spermatogenetic, sin embargo, debido a la baja actividad de reparación, maduro espermatozoides son incapaces de reparación de DSB. Además, DSB también puede ser reparado por recombinación homóloga (HR), que es más preciso y presenta un menor número de errores en el proceso de reparación, mientras que, sin embargo, no ha visto en el proceso de inserción ADNmt ;. Además del NHEJ canónico, los DSB se reparan mediante un mecanismo que implica secuencias que contienen algunos nucleótidos homólogos en los extremos de un DSB que se van a ligar. Este mecanismo se conoce como unión de extremos mediada por microhomología abreviado como MMEJ. MMEJ es el mecanismo de reparación de DSB más mutagénico debido a la generación de deleciones, inserción de varios tamaños y otros reordenamientos del genoma en mamíferos. Como se muestra en la figura 3, los procesos de inserción de ADNmt y reparación de DSB incluyen algunos pasos que son alineación de segmentos de ADN, procesamiento de extremos de ADN, síntesis de ADN y ligación. En cada paso, se requieren ciertos complejos de proteínas para facilitar la ocurrencia de los eventos indicados. Como se muestra en la figura 3, en NHEJ, el heterodímero Ku70 / Ku80 y la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK) , para unir los fragmentos de ADN, la nucleasa de Artemis y la polinucleótido quinasa 3 'fosfatasa (PNKP) , para el procesamiento final , Las ADN polimerasas de la familia X (Pol μ y Pol λ) y la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) , para la síntesis de ADN, y el complejo XLF / XRCC4 / LigIV , para completar la reparación y unir los extremos mediante un enlace fosfodiéster, son los complejos proteicos involucrados en el proceso de reparación de DSB en muchos organismos superiores. Las ADN polimerasas (Pol μ y Pol λ) y el complejo XLF / XRCC4 / LigIV se comparten entre dos máquinas de reparación NHEJ y MMEJ y tienen la misma responsabilidad en ambos procesos de reparación. El primer paso de MMEJ lo realizan los complejos de proteínas WRN , Artemis, DNA-PK y XRCC4 que procesan los extremos de los fragmentos de DSB y mtDNA además de alinearlos para que las polimerasas y ligasas puedan completar la inserción de NUMT (figura 3). ).
Modificación posterior a la inserción: el patrón complejo de NUMT en comparación con la pieza mitocondrial única, la aparición de ADN mitocondrial no continuo en el genoma nuclear y, posiblemente, la diferente orientación de estos fragmentos son la evidencia de procesos posteriores a la inserción de NUMT dentro el genoma nuclear. La causa de estos patrones complejos podría ser el resultado de múltiples inserciones NUMT en puntos calientes de inserción. Además, la duplicación después de la inserción contribuye a la diversidad NUMT. Los NUMT no tienen mecanismo de autorreplicación o mecanismo de transposición; por lo tanto, se espera que la duplicación NUMT ocurra en tándem o que implique una duplicación segmentaria más grande a tasas representativas del resto del genoma. La evidencia de duplicaciones NUMT que no están próximas a otras NUMT está presente en muchos genomas y probablemente ocurre como parte de la duplicación segmentaria. Sin embargo, las duplicaciones de NUMT específicas de humanos recientes como parte de la duplicación segmentaria parecen ser raras; en los seres humanos, solo unos pocos NUMT se superponen con la duplicación segmentaria, y esos NUMT se encontraron solo en una de las copias mientras que faltaban en las otras, lo que demuestra claramente que los NUMT se insertaron después de los eventos de duplicación. La eliminación es otro método de modificación posterior a la inserción de NUMT que aún no se ha estudiado con el mismo nivel de detalle que una inserción. La erosión constante de las señales filogénicas y la alta tasa de mutación en el ADNmt animal dificultan el reconocimiento de dicha modificación, especialmente la deleción. El estudio de los casos en los que el patrón de presencia-ausencia de NUMT no concuerda con el árbol filogenético , debería posibilitar la detección de pérdidas recientes de NUMT mediante el uso de múltiples alineamientos genómicos con la presencia de un exogrupo. Bensasson y los miembros de su equipo utilizaron este método para estimar el NUMT insertado más antiguo en humanos, que data de hace unos 58 millones de años.
Características generales de NUMT
Como el número de mitocondrias y su nivel funcional difiere entre los organismos eucariotas, la longitud, estructura y secuencia de los NUMT varían drásticamente. Los investigadores han descubierto que las inserciones NUMT recientes se derivan de diferentes segmentos del genoma mitocondrial, incluido el bucle D y, en algunos casos extremos, varios, casi, el genoma mitocondrial de longitud completa. La secuencia, la frecuencia, la distribución del tamaño e incluso las dificultades para encontrar estas secuencias en el genoma varían sustancialmente entre las especies. La mayoría de los fragmentos de ADN transferidos desde las mitocondrias y plástidos al genoma nuclear tienen un tamaño inferior a 1 kb. Sin embargo, en algunos genomas de las plantas se encuentran fragmentos extremadamente grandes de ADN de orgánulos.
A medida que el genoma evoluciona y se altera con el tiempo por mutación, el número de NUMT en el genoma difiere a lo largo de la evolución. NUMT entra en el núcleo y se inserta en el nDNA en diferentes etapas del tiempo. Debido a la constante mutación e inestabilidad de NUMT, la semejanza de este tramo del genoma con el mtDNA varía ampliamente en el reino Animalia e incluso dentro de cierto genoma. Por ejemplo, el último número de NUMT registrado en el genoma humano es de 755 fragmentos que van desde 39 pb hasta casi toda la secuencia mitocondrial en tamaño. Hay 33 secuencias parálogas con más del 80% de similitud de secuencia y de una longitud superior a 500 pb. Además, no todos los fragmentos NUMT del genoma son el resultado de la migración del mtDNA; algunos son el resultado de la amplificación después de la inserción. Se ha descubierto que los NUMT antiguos son más abundantes en el genoma humano que los integrantes recientes, lo que indica que el ADNmt puede amplificarse una vez insertado. Dayama y col. desarrolló una nueva técnica de alto rendimiento para la detección exacta del número de NUMT en el genoma humano llamada dinumt . Este método les permite a ella y a los miembros de su equipo identificar inserciones NUMT, de todos los tamaños, en los genomas completos secuenciados utilizando tecnología de secuenciación de extremos emparejados con una mayor sensibilidad. Aplicaron dinumt a 999 individuos del Proyecto 1000 Genomas y el Proyecto de Diversidad del Genoma Humano (HGDP) y realizaron un análisis de enriquecimiento actualizado en humanos utilizando estas inserciones polimórficas . La investigación adicional y el genotipado del NUMT descubierto también analiza la edad de inserción, el origen y las características de la secuencia. Finalmente, evaluaron su impacto potencial en los estudios en curso de heteroplasmia mitocondrial.
Como se mencionó anteriormente, el mtDNA se inserta en el genoma nuclear solo cuando un DSB es producido por factores dañinos endógenos o exógenos. Sin embargo, el mtDNA no se inserta en ninguna ubicación dentro del genoma. Además, no existe correlación entre la fracción de ADN no codificante y la abundancia de NUMT; Además, Antunes y Ramos descubrieron que los NUMT antiguos se insertan preferentemente en los loci conocidos y predichos, como se infiere para los NUMT recientes en el genoma humano, durante su vigoroso trabajo sobre la secuencia NUMT en peces utilizando el método de análisis BLASTN. Por lo tanto, en base a estos estudios, se encuentra que la inserción de NUMT en el genoma nuclear no es aleatoria. Uno de los mejores estudios que demuestran la distribución e inserción no aleatoria de NUMT en el genoma nuclear es el realizado por Tsuji y sus compañeros de equipo. Usando el método LAST en lugar de BLAST, que hace posible calcular el valor E con mayor precisión y no sub-representa los elementos repetitivos en los flancos NUMT, Tsuji y su compañero de equipo pudieron caracterizar la ubicación de la inserción NUMT con precisión. Descubrieron que los fragmentos NUMT tienden a insertarse en las regiones con alta curvatura o flexibilidad del ADN local y oligómeros ricos en A + T, especialmente TAT. Además, los NUMT se insertan principalmente en regiones de cromatina abiertas. Utilizando el mismo método, Tsuji mostró que los NUMT no suelen agruparse y los NUMT producidos por el bucle D suelen estar subrepresentados, lo que es más evidente en monos y humanos en comparación con ratas y ratones debido a la longitud total de sus NUMT. Sin embargo, Tsuji también encontró que la estructura del retrotransposón está altamente enriquecida en los flancos NUMT y la mayoría de los NUMT se insertan en las proximidades del retrotransposón, mientras que solo unos pocos, 10 de 557 NUMT, se insertaron dentro de un retrotransposón, no pudieron encontrar ninguna relación clara del tamaño de ADN no codificante y el número de NUMT.
Consecuencias de la integración de novo de insertos NUMT
Los NUMT no carecen del todo de funciones y se les asocian determinadas funciones. Aunque la inserción de NUMT se consideraba anteriormente como pseudogenes sin función, se ha demostrado que las NUMT humanas recientes son un proceso potencialmente mutagénico que podría dañar la integridad funcional del genoma humano. La acumulación de mutación en NUMT, alteración posinsercional, mecanismo mutagénico de inserción de NUMT, MMEJ y NHEJ, DSB, así como el lugar en el que se encuentra el punto caliente de inserción pueden causar mutaciones y alteraciones dramáticas de la estructura del genoma en el sitio de integración. , interfieren con la función del genoma y ejercen efectos sustanciales sobre la expresión de la información genética. Además, la integración de secuencias de mtDNA afecta sustancialmente a la organización espacial del nDNA y puede desempeñar un papel importante en la evolución de los genomas eucariotas. Además del efecto negativo del mtDNA, es probable que los antiguos NUMT conservados en el genoma representen éxitos evolutivos y deben considerarse como un mecanismo evolutivo potencial para la mejora de las regiones codificantes genómicas. Además, Chatre y Ricchetti, con la utilización de electroforesis en gel bidimensional , construcción de plásmido , mutagénesis , en un análisis silico de motivos ACS y un ensayo de tasa de pérdida de plásmido, encontraron que los ADN mitocondriales migratorios pueden afectar la replicación de la región nuclear en la que se encuentran. insertado. A través de su evidencia funcional, demostraron que las secuencias de origen mitocondrial promueven la replicación del nDNA en Saccharomyces cerevisiae . Las NUMT son secuencias de consenso (ACS) de ARS core-A ricas de 11 pb , cuya presencia en las coincidencias con estos motivos de consenso, en el origen de replicación de Saccharomyces cerevisiae , es necesaria pero no suficiente para la función del origen de replicación y cualquier mutación en este consenso provoca la reducción o pérdida de la actividad de replicación del ADN. Dada la alta densidad de motivos ACS, algunos NUMT aparecen esencialmente como portadores ACS. En contraste, la eficiencia de replicación es mayor en aquellas cepas de levadura que tienen plásmidos que contienen tanto NUMT como ARS. También encontraron que algunos NUMT pueden funcionar como una bifurcación de replicación independiente y los orígenes cromosómicos tardíos y los NUMT ubicados cerca o dentro de ARS proporcionan elementos de secuencia clave para la replicación. Por lo tanto, los NUMT pueden actuar como orígenes independientes, cuando se insertan en un contexto genómico apropiado o afectan la eficiencia de los orígenes preexistentes.
Enfermedades y trastornos: la inserción de NUMT en el genoma puede ser problemática. La transposición de NUMT al genoma también se ha asociado con enfermedades humanas. La integración de novo de los pseudogenes NUMT en el genoma nuclear tiene un efecto adverso en algunos casos, promoviendo diversos trastornos y el envejecimiento. La integración del ADNmt en los genes codificantes de las células de la línea germinal tiene consecuencias dramáticas para el desarrollo del embrión y, en muchos casos, es letal. Pocos pseudogenes NUMT asociados con enfermedades se encuentran dentro de los exones o en los límites exón-intrón de los genes humanos. Por ejemplo, los pacientes con síndrome de mucolipidosis heredan una mutación causada por la inserción de un fragmento de 93 pb de ND5 mitocondrial en el exón 2 del gen de mucolipina R403C. Este es el primer caso de un trastorno hereditario debido al inserto NUMT. A pesar del pequeño grupo de tratamiento, el trasplante de células madre resultó ser efectivo y los niveles de enzimas lisosomales parecieron normalizarse después del trasplante en al menos un caso. El síndrome de Pallister-Hall , un trastorno del desarrollo, en otro ejemplo, donde un trastorno funcional de un gen clave del desarrollo resulta de una inserción de novo de un fragmento de ADNmt de 72 pb en el exón 14 de GLI3 en el cromosoma 7 , lo que da como resultado polidactilia central y postaxial . epiglotis bífida, ano imperforado, anomalías renales que incluyen malformaciones quísticas, hipoplasia renal , implantación ureteral ectópica y anomalías de segmentación pulmonar como pulmones bilobulados bilaterales. Una mutación en el sitio de corte y empalme en el gen humano del factor VII plasmático que causa una deficiencia grave del factor VII plasmático, enfermedad hemorrágica, es el resultado de una inserción de NUMT de 251 pb. Como último ejemplo conocido, una inserción de 36 pb en el exón 9 del gen USH1C asociado con el síndrome de Usher tipo IC es el NUMT. Aún no se ha encontrado una maldición segura para el síndrome de Usher ; sin embargo, se está llevando a cabo un estudio clínico actual en 18 voluntarios para determinar la influencia de UshStat tanto a corto como a largo plazo. Este estudio se inició en septiembre de 2013 y se estima que estará listo para octubre de 2023.
Envejecimiento: varios estudios indicaron que la aparición de novo de pseudogenes NUMT en el genoma de las células somáticas puede ser de importancia etiológica para la carcinogénesis y el envejecimiento. Para mostrar la relación entre envejecimiento y NUMT en el genoma nuclear, Cheng e Ivessa utilizaron cepas mutantes yme1-1 de Saccharomyces Cerevisiae que tienen una tasa más alta de migración de mtDNA. El método es exactamente el mismo que el método que Thorsness y Fox utilizaron para determinar los mecanismos y factores importantes para la migración del mtDNA al núcleo. Descubrieron que las cepas de levadura con tasas elevadas de migración de fragmentos de ADNmt al núcleo mostraban un envejecimiento cronológico acelerado, mientras que las cepas con tasas de transferencia de ADNmt disminuidas al núcleo exhibían un CLS extendido, una vida útil cronológica que posiblemente podría deberse al efecto de NUMT. sobre procesos nucleares que incluyen la replicación, recombinación y reparación del ADN, así como la transcripción de genes. El efecto de NUMT en los organismos eucariotas superiores fue investigado por Caro y sus compañeros de equipo en las ratas como organismo modelo. Utilizando una cuantificación de PCR en tiempo real, la hibridación in situ de mtDNA a nDNA y la comparación de ratas jóvenes y viejas, Caro y su equipo no solo pudieron determinar la alta concentración de citocromo oxidasa III y rRNA 16S a partir de mtDNA en ratas jóvenes y viejas. , pero también podrían descubrir el aumento en el número de secuencias mitocondriales en el ADNn a medida que la rata envejece. Por lo tanto, según estos hallazgos, las mitocondrias pueden ser un desencadenante importante del envejecimiento, pero el objetivo final también podría ser el núcleo.
Cáncer: el impacto más terrible de la inserción de NUMT ocurre cuando el ADNmt se inserta en la región reguladora o en los genes estructurales nucleares y altera o altera los procesos celulares vitales. Por ejemplo, en las neoplasias cerebrales primarias de bajo grado, el análisis de hibridación in situ fluorescente ayudó con el reconocimiento del mtDNA localizado en el núcleo en correlación con un aumento general en el contenido de mtDNA en la célula. Este evento ontogénicamente temprano es importante en la etiología de estos tumores. De manera similar, en las células de hepatoma , las secuencias de ADNmt están presentes en el genoma nuclear en un número de copias más alto en contraste con los tejidos normales. Otro ejemplo sería el nDNA de HeLa que contiene secuencias que hibridan con fragmentos de mtDNA de aproximadamente 5 kb. Un análisis mostró que el ADNn de las células malignas contiene secuencias de los genes de ARNr de la citocromo oxidasa I , ND4 , ND4L y 12S de las mitocondrias . Con base en estos hallazgos, se asumió que los fragmentos de ADNmt actúan como un elemento genético móvil en el inicio de la carcinogénesis . La transferencia de Southern es el método utilizado para determinar la frecuencia de inserción mitocondrial en el ADNn de las células normales y tumorales de ratones y ratas, que demostró que las secuencias de ADNmt son mucho más numerosas y abundantes en el ADNn de las células tumorales de roedores en comparación con las células normales. . Usando sondas FISH, PCR y secuenciación de datos, mapeo y comparación, Ju y su compañero de equipo encontraron que las fusiones del genoma mitocondrial-nuclear ocurren a una tasa similar por par de bases de ADN como reordenamientos nucleares intercromosómicos, lo que indica la presencia de una alta frecuencia de contacto entre ADN mitocondrial y nuclear en algunas células somáticas. Además, Ju y sus compañeros de equipo investigaron el momento de la integración del mtDNA somático en el genoma nuclear mediante la evaluación de casos en los que se había secuenciado una muestra metastásica además del tumor primario. En algunos casos, las transferencias de ADNmt al núcleo de las células somáticas son muy frecuentes y pueden ocurrir después de la formación neoplásica y durante el curso de la evolución subclonal del cáncer, lo que sugiere que este evento ocurre en los clones de cáncer ancestrales comunes o en células somáticas normales antes de la aparición del cáncer. cambio neoplásico. Estos hallazgos demostraron que la presencia de una correlación directa entre NUMT y cáncer en diferentes órganos del cuerpo. Comprender la relación, el momento de la inserción de NUMT, la ubicación de la inserción y los genes alterados ayudaría a producir una medicina más poderosa y eficaz.
Usos experimentales y errores
Aunque comprender la inserción no aleatoria de NUMT y llevar a cabo determinadas funciones después de la inserción, ayuda a revelar la estructura y determinar la función completa del genoma, especialmente el genoma humano, las NUMT se han utilizado como herramientas experimentales y han sido beneficiosas en diferentes campos biológicos incluso antes de tener conocimiento sobre la función de los NUMT. Por ejemplo, los NUMT se pueden usar no solo como marcadores genéticos, sino también como una herramienta para comprender la tasa relativa de mutación en el núcleo y las mitocondrias, así como para recrear árboles evolutivos. El proceso continuo de integración de NUMT en el genoma nuclear se evidencia por el hallazgo de NUMT que se han insertado en el genoma humano después de la divergencia entre humanos y chimpancés. Algunas de estas NUMT son variables con respecto a la presencia o ausencia genómica, lo que indica que solo han surgido recientemente en la población humana, lo que permite su uso como marcadores genéticos de linaje. Usando un protocolo basado en la alineación del genoma para estimar el número de NUMT en especies estrechamente relacionadas, Hazkani-Covo y Graur no solo pudieron identificar eventos evolutivos que pueden haber afectado la composición de NUMT en cada genoma, sino que también podrían reconstruir la composición de NUMT en el ancestro común de humanos y chimpancés. Los NUMT también se pueden utilizar para comparar la tasa de evolución de la secuencia nuclear no funcional con la del mtDNA funcional y determinar la tasa de evolución por la tasa de acumulación de mutaciones a lo largo de las secuencias NUMT a lo largo del tiempo. Las regiones menos restringidas selectivamente son los segmentos con mayor divergencia de la secuencia mitocondrial. Una de las aplicaciones más prometedoras del estudio NUMT es su uso en el estudio de la mutación nuclear. En los metazoos , los NUMT se consideran no funcionales. Por tanto, las mutaciones nucleares se pueden distinguir de los cambios mitocondriales y sería posible el estudio de la sustitución, inserción y deleción de nucleótidos. Además, la homología de secuencias NUMT parálogas con el mtDNA permite probar los efectos de la secuencia local sobre la mutación. Toda esta información obtenida del estudio de los fragmentos NUMT podría usarse para comprender la evolución mitocondrial así como los procesos evolutivos a lo largo de la historia.
Los NUMT ofrecen la oportunidad de estudiar la diversidad antigua de linajes mitocondriales y descubrir la hibridación interespecies prehistórica. La hibridación antigua se ha detectado por primera vez (utilizando NUMT) en colas de cerdas, luego en monos colobine y, más recientemente, en un ancestro humano directo. La hibridación de homínidos ocurrió aproximadamente en el momento de la separación humano / chimpancé / gorila . Este último estudio se refiere a un NUMT humano compartido con chimpancés y gorila. La filogenia conjunta de las tres secuencias NUMT y los genomas mitocondriales de los grandes simios implica que un ancestro común de los tres NUMT se ha transferido al linaje humano / chimpancé / gorila de una especie de homínido separada de ellos por aproximadamente 4.5 millones de años de evolución del ADNmt. Si bien la hibridación de esta magnitud no es desconocida entre los primates, su aparición en el linaje humano directo, alrededor del momento crítico de la especiación humano / simio, es un resultado sorprendente. NUMT adicionales con filogenias similares indican que tales eventos pueden no ser únicos.
Otro problema surgió de la presencia de NUMT en el genoma asociado con la dificultad de determinar el número exacto de inserciones mitocondriales en el nDNA. Determinar el número exacto de pseudogenes NUMT para una especie es una tarea difícil por varias razones. Una razón que dificulta la detección de secuencias NUMT es la alteración de estas secuencias por mutación y deleción. Otros dos obstáculos sustanciales dificultan enormemente el reconocimiento de NUMT; primero es la falta de correlación entre la proporción de nDNA no codificante y el número de insertos NUMT en el genoma nuclear. Es decir, la inserción de NUMT podría ocurrir en la región codificante conocida o predicha, tanto en el intrón como en el exón, en lugar de solo en la región intergénica e intrónica. En segundo lugar, el ADN mitocondrial integrado en genomas nucleares animales se limita principalmente a animales con genomas mitocondriales circulares sin intrones. Los estudios NUMT no están disponibles en animales con genomas mitocondriales lineales o aquellos con mitocondrias que contienen intrones. Por lo tanto, a pesar de todas las tecnologías avanzadas disponibles, queda por determinar si existen diferencias de transposición NUMT entre los ADNmt circulares y lineales.
Estas dificultades para detectar la presencia de NUMT pueden ser problemáticas. Las secuencias mitocondriales translocadas en el genoma nuclear tienen el potencial de amplificarse además de, o incluso en lugar de, la secuencia de ADNmt diana auténtica, lo que puede confundir seriamente los análisis filogenéticos y genéticos de la población, ya que el ADNmt se ha utilizado ampliamente para el mapeo de poblaciones, estudios evolutivos y filogenéticos. , identificación de especies por código de barras de ADN, diagnóstico de diversas patologías y medicina forense. Esta amplificación simultánea de NUMT con ADNmt extracromosómico libre, además, evita que se pueda determinar el número exacto de fragmentos NUMT en el genoma de diferentes organismos, como los mosquitos Aedes aegypti , especialmente aquellos en los que se produce una translocación extendida de fragmentos de ADNmt. Esto dificulta el diagnóstico de ciertos trastornos mitocondriales. Por ejemplo, se encontró un gran pseudogén NUMT en el cromosoma 1, mientras que un análisis más reciente de la misma secuencia llevó a la conclusión de que el ADNmt del esperma tiene mutaciones que causan una baja movilidad de los espermatozoides. Otro ejemplo sería el informe reciente que describe una molécula de ADNmt heteroplasmático que contiene cinco mutaciones de sentido erróneo enlazadas dispersas sobre los genes CO1 y CO2 de ADNmt contiguos en pacientes con enfermedad de Alzheimer ; sin embargo, se propusieron los estudios más recientes que utilizan PCR, ensayos de variantes de sitios de endonucleasas de restricción y análisis filogénico. que las secuencias nucleares de CO1 y CO2 revelaron que divergían de los ADNmt humanos modernos al principio de la evolución de los homínidos unos 770.000 años antes y estos NUMT conservados podrían causar la enfermedad de Alzheimer. Una de las posibles formas de prevenir este resultado erróneo es una amplificación y comparación de secuencia heterogénea, que comprende tanto mtDNA como nDNA, con los resultados obtenidos de la secuenciación de Sanger de mtDNA purificado y enriquecido como se muestra en la figura 4. Aunque este método es fácil y solo se requieren unos pocos cebadores, evitará un error sustancial en los estudios filogenéticos de una población y todos los resultados falsos mencionados anteriormente.
Referencias
Ver también
