Odwrotna transkryptaza
| odwrotna transkryptaza | ||
|---|---|---|
 | ||
| Identyfikatory | ||
| Identyfikatory zewnętrzne | ||
Odwrotna transkryptaza (również odwrotna transkryptaza, odwrotna transkryptaza ) jest enzymem typu polimerazy DNA, którego zadaniem jest synteza dwuniciowego DNA przy użyciu jednoniciowego RNA jako matrycy , czyli katalizowanie retrotranskrypcji lub odwrotnej transkrypcji . Występuje w retrowirusach . Jego nazwa wynika z faktu, że normalny proces transkrypcji , który można nazwać „bezpośrednim”, koduje RNA z początkowej sekwencji DNA, a nie odwrotnie. [ potrzebne cytowanie ]
Prostym sposobem syntezy dwuniciowego DNA z odwrotnej transkryptazy, zwanej również ukierunkowaną polimerazą DNA/RNA, byłby starter z ogonem poli-T, który utworzyłby komplementarne zasady z ogonem poli-A RNA transkrybowanego z nici, która ma być zsyntetyzowany, tworząc hybrydę RNA/DNA. Ta hybryda może być rozdzielona rybonukleazami, a następnie, dzięki działaniu polimerazy DNA i nowego startera, dwuniciowa nić DNA może zostać uzupełniona. [ potrzebne cytowanie ]
W biologii molekularnej i biochemii odwrotna transkryptaza, znana również jako polimeraza DNA zależna od RNA, jest enzymem polimerazy DNA, który transkrybuje z pojedynczej nici RNA pojedynczą nić DNA. Pomaga również w tworzeniu podwójnej helisy DNA, gdy RNA zostanie poddane odwrotnej transkrypcji do jednoniciowego cDNA. Odwrotna transkrypcja obejmuje syntezę DNA z RNA.
Odwrotną transkryptazę odkrył Howard Temin na Uniwersytecie Wisconsin-Madison i niezależnie David Baltimore w 1970 roku w MIT . Oboje otrzymali w 1975 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny z Renato Dulbecco za swoje odkrycie. Dobrze zbadane odwrotne transkryptazy obejmują:
- Odwrotna transkryptaza ludzkiego wirusa niedoboru odporności HIV-1 (patrz podtypy HIV )
- Odwrotna transkryptaza M-MLV wirusa mysiej białaczki Moloneya
- Odwrotna transkryptaza AMV z wirusa ptasiej mieloblastozy
- telomeraza , odwrotna transkryptaza utrzymująca telomery chromosomów eukariotycznych
Funkcja wirusów
Enzym jest kodowany i wykorzystywany przez wirusy w odwrotnej transkrypcji, wykorzystują enzym podczas procesu replikacji. Odwrotna transkrypcja wirusów RNA, takich jak retrowirusy , wykorzystują enzym w swoim genomie do przejścia RNA do DNA, który integruje się z genomem gospodarza i wraz z nim replikuje. Odwrotna transkrypcja wirusów DNA, takich jak hepadnawirus , może pozwolić RNA służyć jako matryca w zespole, tworząc nici DNA. HIV infekuje ludzi dzięki temu enzymowi. Bez odwrotnej transkryptazy genom wirusa nie byłby w stanie włączyć się do komórki gospodarza z powodu niezdolności wirusów do samodzielnej replikacji. W przeciwieństwie do bakterii, retrowirusy wykorzystują jako startery transferowe RNA zakodowane w komórce gospodarza.
Proces odwrotnej transkrypcji
Odwrotna transkryptaza tworzy jednoniciowy DNA z matrycy RNA. Wirusy pozbawione odwrotnej transkryptazy syntetyzują swoje DNA dzięki kodowanej przez DNA polimerazie δ komórki gospodarza, która błędnie myli RNA wirusa jako inicjator i syntetyzuje dwuniciowy DNA ze względu na podobieństwo mechanizmu eliminacji nowo zsyntetyzowany DNA wypiera oryginalny matrycowy RNA.
Proces odwrotnej transkrypcji jest bardzo podatny na błędy i właśnie na tym etapie mogą wystąpić mutacje. Te mutacje mogą powodować lekooporność.
Proces odwrotnej transkrypcji w wirusie klasy VI
Wirusy klasy VI ssRNA-TR, zwane również retrowirusami , są wirusami RNA z odwrotną transkrypcją z pośrednim DNA. Jego genom składa się z dwóch jednoniciowych cząsteczek RNA o dodatnim znaczeniu z czapeczką 5' i poliadenylowanym ogonem 3'. Przykładami retrowirusów są ludzki wirus niedoboru odporności ( "HIV" ) i ludzki wirus T-limfotropowy ( "HTLV" ). Odbywa się w cytozolu . [ 2 ] Tworzenie dwuniciowego DNA odbywa się w szeregu etapów:
- Specyficzne dla komórki tRNA działa jak starter i hybrydyzuje z komplementarną częścią genomu wirusa zwaną miejscem wiązania startera (PBS).
- Komplementarny DNA jest syntetyzowany w kierunku końca 5', komplementarnego do regionów U5 (region niekodujący) i R (bezpośrednie powtórzenie znajdujące się na obu końcach cząsteczki RNA) wirusowego RNA.
- Domena enzymu odwrotnej transkryptazy o nazwie RNaza H degraduje RNA na końcu 5', eliminując regiony U5 i R, w wyniku czego powstaje jednoniciowy DNA (ssDNA).
- Starter tRNA i dołączony ssDNA przeskakują na koniec 3' genomu wirusa i nowo zsyntetyzowane DNA przyłącza się do komplementarnego regionu R na RNA.
- Pierwsza komplementarna cząsteczka DNA (cDNA) rozszerza swoją syntezę na region PBS. Większość wirusowego RNA jest degradowana przez RNazę H, z wyjątkiem regionu PP.
- Gdy pierwsza nić DNA jest kompletna, działa jako nić komplementarna do syntezy drugiej nici DNA, która zaczyna się od regionu PP wirusowego RNA, wykorzystując ten pozostały fragment RNA jako starter ]3[ Druga nić DNA rozciąga się od PP przez U3, R do U5.
- Następnie następuje kolejny „skok” drugiej nici DNA i regiony PBS obu nici będą hybrydyzować.
- Oba prądy kończą się rozciąganiem (zawsze w kierunku 5'->3') i wreszcie mogą zostać włączone do genomu gospodarza dzięki enzymowi integrazy .
Tworzenie podwójnej helisy DNA obejmuje również transfer nici , w którym następuje translokacja krótkiego produktu DNA z początkowej syntezy DNA zależnej od RNA do akceptorowych regionów wzorcowych na drugim końcu genomu, który jest następnie osiągany i przetwarzany przez odwrotną transkryptazę w celu ich Aktywność DNA zależna od DNA. [ 4 ]
Retrowirusowy RNA jest ułożony od 5' do końca 3'. Starter jest przyłączany przez wirusowy RNA w miejscu wiązania startera (PBS). Koniec 5' RNA nazywa się U5, a 3' RNA nazywa się liderem. Pierwsze opracowane tRNA składało się z 14-22 nukleotydów i tworzyło sparowany zasadowo dupleks z wirusowym RNA w PBS. Rzadko zdarza się, aby PBS znajdował się w pobliżu końca 5' wirusowego RNA, ponieważ odwrotna transkryptaza syntetyzuje DNA z końca 3' nici w kierunku od 5' do 3'. Dlatego starter i odwrotna transkryptaza muszą zostać przeniesione na koniec 3' wirusowego RNA. Aby przeprowadzić tę zamianę, konieczne są liczne pomiary i różne enzymy, takie jak polimeraza DNA, rybonukleaza H (RNaza H) i proste polinukleotydy. [ 5 ]
Odwrotna transkryptaza HIV ma również aktywność rybonukleazy , to znaczy degraduje wirusowy RNA podczas syntezy DNA, a także aktywność polimerazy DNA zależnej od DNA, która kopiuje sensowną nić cDNA do antysensownego DNA, tworząc podwójną helisę pośredniego DNA wirusa ( vDNA). [ 6 ]
u eukariontów
Samoreplikujące się odcinki genomu eukariotycznego , znane jako retrotranspozony, wykorzystują odwrotną transkryptazę do przemieszczania się z jednej pozycji w genomie do drugiej za pośrednictwem pośredniego RNA. Występują obficie w genomach roślin i zwierząt. Telomeraza to kolejna odwrotna transkryptaza eukariontów, w tym ludzi, która nosi własną matrycę RNA , która jest używana do replikacji DNA . [ 7 ]
u prokariontów
Odwrotne transkryptazy znajdują się również w bakteriach Retron msr RNA, odrębne sekwencje kodujące odwrotną transkryptazę i są wykorzystywane w syntezie msDNA. Aby rozpocząć syntezę DNA, potrzebny jest starter. W bakteriach starter jest syntetyzowany podczas replikacji. [ 8 ]
Struktura
Odwrotne transkryptazy to heterodimery , które obejmują polimerazę DNA zależną od RNA i polimerazę DNA zależną od DNA, które współpracują ze sobą w celu przeprowadzenia transkrypcji. Oprócz funkcji transkrypcji retrowirusowe odwrotne transkryptazy mają domenę należącą do rodziny RNazy H , która jest niezbędna do ich replikacji.
Wierność replikacji
W cyklu życiowym retrowirusa istnieją trzy różne systemy replikacji. Najpierw odwrotna transkryptaza syntetyzuje wirusowy DNA z wirusowego RNA, a następnie z nowo utworzonej komplementarnej nici DNA. Drugi proces replikacji komórki zachodzi, gdy polimeraza DNA komórki gospodarza replikuje zintegrowany wirusowy DNA. Wreszcie polimeraza RNA II dokonuje transkrypcji prowirusowego DNA na RNA, który jest umieszczany w wirionach. Dlatego mutacja może wystąpić podczas jednego lub wszystkich tych etapów replikacji. [ 9 ]
Odwrotna transkryptaza ma wysoki wskaźnik błędów podczas transkrypcji RNA do DNA, ponieważ w przeciwieństwie do polimeraz DNA nie ma możliwości korygowania błędów. Ten wysoki wskaźnik błędów umożliwia akumulację mutacji w przyspieszonym tempie w stosunku do prawidłowych form replikacji. Dostępna na rynku odwrotna transkryptaza produkowana przez firmę Promega ma wskaźnik błędu w zakresie 1 na 17 000 zasad dla AMV i 1 na 30 000 zasad dla M-MLV. [ 10 ]
Aplikacje
Leki przeciwwirusowe
Ponieważ wirus HIV wykorzystuje odwrotną transkryptazę do kopiowania swojego materiału genetycznego i generowania nowych wirusów (część kręgu proliferacji retrowirusów), opracowano specjalne leki, które przerywają ten proces, a tym samym hamują jego wzrost. Łącznie leki te są znane jako inhibitory odwrotnej transkryptazy i obejmują nukleozydy i analogi nukleozydów zydowudynę (nazwa handlowa Retrovir), lamiwudynę (Epivir) i tenofowir (Viread), a także inhibitory nienukleozydowe, takie jak newirapina (Viramune) . .
Biologia molekularna
Odwrotna transkryptaza jest powszechnie stosowana w badaniach nad zastosowaniem techniki łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Klasyczną technikę PCR można zastosować tylko do nici DNA , ale za pomocą odwrotnej transkryptazy RNA można przepisać na DNA, co umożliwia analizę PCR cząsteczek RNA. Odwrotną transkryptazę stosuje się również do tworzenia bibliotek cDNA mRNA. Dostępność komercyjna odwrotnej transkryptazy znacznie poszerzyła wiedzę z zakresu biologii molekularnej, ponieważ wraz z innymi enzymami umożliwiła naukowcom klonowanie, sekwencjonowanie i charakteryzowanie DNA.
Historia
Idea odwrotnej transkrypcji była początkowo bardzo niepopularna, ponieważ była sprzeczna z centralnym dogmatem biologii molekularnej , który głosi, że DNA ulega transkrypcji na RNA, które jest tłumaczone na białko. Jednak w 1970 roku, kiedy naukowcy Howard Temin i David Baltimore niezależnie odkryli enzym odpowiedzialny za odwrotną transkrypcję, zwany odwrotną transkryptazą, ostatecznie zaakceptowano możliwość przekazywania informacji genetycznej w ten sposób.
Zobacz także
- polimeraza DNA
- polimeraza RNA
- Biblioteka DNA
- marker retrotranspozonowy
- msDNA
- Telomeraza
- wirus odwrotnej transkrypcji
Referencje
- ↑ PDB3KLF ; _ Tu X, Das K, Han Q, Bauman JD, Clark AD Jr, Hou X, Frenkel YV, Gaffney BL, Jones RA, Boyer PL, Hughes SH, Sarafianos SG, Arnold E (wrzesień 2010). „Strukturalne podstawy odporności HIV-1 na AZT przez wycięcie”. . Struktura narodowa. Mol. Biol.17 ( 10 ): 1202-9. PMC 2987654 . PMID 20852643 . doi : 10.1038/nsmb.1908 .
- ↑ Bio-Medicine.org - Retrowirus pobrany 17 lutego 2009 r.
- ^ „Skoki i przerwy w odwrotnej transkryptazie” . Journal of General Virology (1996), 77, 1987-1991. Wydrukowano w Wielkiej Brytanii . Źródło 20 maja 2017 .
- ↑ Telesnitsky, A., Goff, SP (1993). «Mocny transfer nici podczas odwrotnej transkrypcji». W Skalce MA, Goff SP, wyd. Odwrotna transkryptaza (wydanie 1.). Nowy Jork: Cold Spring Harbor. p. 49. ISBN 0-87969-382-7 .
- ^ Bernstein A.; Weissa, Robin; Tooze, John (1985). Wirusy nowotworowe RNA. Biologia molekularna wirusów nowotworowych (wydanie drugie). Cold Spring Harbor, NY: Laboratorium Cold Spring Harbor.
- ↑ Strona domowa mikrobiologii doktora Kaisera > IV. WIRUSY > F. CYKLE ŻYCIA WIRUSÓW ZWIERZĄT > 3. Cykl życia HIV Community College of Baltimore County. Aktualizacja: styczeń 2008
- ↑ Monty Krieger; Mateusz P. Scott; Matsudaira, Paul T.; Lodish, Harvey F.; Darnell, James E.; Lawrence Zipursky; Kaiser, Chris; Arnolda Berka (2004). Biologia komórki molekularnej (wydanie 5). Nowy Jork: WH Freeman i CO. ISBN 0-7167-4366-3 .
- ↑ Hurwitz J, Leis JP (styczeń 1972). «Aktywność polimerazy DNA zależnej od RNA wirusów nowotworów RNA. I. Kierunkowe oddziaływanie DNA na reakcję» . J. Virol. 9 (1): 116-29. PMC 356270 . PMID 4333538 .
- ↑ Bbenek, K., Kunkel, AT (1993). „Wierność retrowirusowych odwrotnych transkryptaz”. W Skalce, MA, Goff, PS, wyd. Odwrotna transkryptaza . Nowy Jork: Cold Spring Harbor Laboratory Press. s. p. 85. ISBN 0-87969-382-7 .
- ↑ Instrukcja obsługi zestawu Promega (1999)
