Cititor de farfurii - Plate reader

Cititoarele de plăci , cunoscute și sub numele de cititoare de microplăci sau fotometre de microplăci , sunt instrumente care sunt utilizate pentru a detecta evenimentele biologice , chimice sau fizice ale probelor din plăcile de microtitrare . Acestea sunt utilizate pe scară largă în cercetare, descoperirea medicamentelor , validarea testelor biologice, controlul calității și procesele de fabricație în industria farmaceutică și biotehnologică și în organizațiile academice. Reacțiile probei pot fi testate în plăci de microtitrare cu format 1-1536. Cel mai obișnuit format de microplacă utilizat în laboratoarele de cercetare academică sau laboratoarele de diagnostic clinic este de 96 de godeuri (matrice 8 x 12), cu un volum de reacție tipic între 100 și 200 µL per godeu. Microplăcile cu densitate mai mare (microplăci de 384 sau 1536 de godeuri) sunt utilizate în mod obișnuit pentru aplicații de screening, când randamentul (numărul de probe pe zi procesate) și costul testului pe probă devin parametri critici, cu un volum tipic de testare între 5 și 50 µL pe godeu . Modurile obișnuite de detecție pentru testele de microplacă sunt absorbanța, intensitatea fluorescenței , luminescența , fluorescența rezolvată în timp și polarizarea fluorescenței .

Metode

Absorbanta

Detectarea absorbției a fost disponibilă în cititoarele de microplăci de mai bine de 3 decenii și este utilizată pentru teste precum teste ELISA , cuantificarea proteinelor și a acidului nucleic sau teste de activitate enzimatică (adică în testul MTT pentru viabilitatea celulară). O sursă de lumină luminează proba folosind o lungime de undă specifică (selectată de un filtru optic sau un monocromator), iar un detector de lumină situat pe cealaltă parte a puțului măsoară cât din lumina inițială (100%) este transmisă prin eșantion : cantitatea de lumină transmisă va fi de obicei legată de concentrația moleculei de interes. Mai multe analize colorimetrice convenționale au fost miniaturizate pentru a funcționa cantitativ într-un cititor de plăci, cu performanțe adecvate scopurilor de cercetare. Exemple de analize convertite în metode de citire a plăcilor includ mai multe pentru amoniu , azotat , nitrit , uree , fier (II) și ortofosfat . Chimii colorimetrice mai recente au fost dezvoltate direct pentru utilizare în cititoarele de plăci.

Fluorescenţă

Detecția intensității fluorescenței s-a dezvoltat foarte larg în formatul microplăcii în ultimele două decenii. Gama de aplicații este mult mai largă decât atunci când se utilizează detectarea absorbanței, dar instrumentele sunt de obicei mai scumpe. În acest tip de instrumentație, un prim sistem optic (sistem de excitație) luminează proba folosind o lungime de undă specifică (selectată de un filtru optic sau un monocromator). Ca rezultat al iluminării, proba emite lumină (fluorescă) și un al doilea sistem optic (sistem de emisie) colectează lumina emisă, o separă de lumina de excitație (folosind un filtru sau un sistem monocromator) și măsoară semnalul folosind un detector de lumină, cum ar fi un tub fotomultiplicator (PMT). Avantajele detectării fluorescenței față de detectarea absorbanței sunt sensibilitatea, precum și domeniul de aplicare, având în vedere selecția largă de etichete fluorescente disponibile astăzi. De exemplu, o tehnică cunoscută sub numele de calciu imagistic măsoară intensitatea fluorescenței coloranților sensibili la calciu pentru a evalua nivelurile de calciu intracelular.

Luminescență

Luminescența este rezultatul unei reacții chimice sau biochimice. Detectarea luminiscenței este mai simplă din punct de vedere optic decât detectarea fluorescenței, deoarece luminescența nu necesită o sursă de lumină pentru excitație sau optică pentru selectarea lungimilor de undă de excitație discrete. Un sistem optic de luminiscență tipic constă dintr-o cameră de citire etanșă la lumină și un detector PMT . Unele cititoare de plăci folosesc un detector PMT analogic, în timp ce altele au un detector PMT de numărare a fotonilor . Numărarea fotonilor este larg acceptată ca fiind cel mai sensibil mijloc de detectare a luminiscenței. Unele cititoare de plăci oferă roți de filtrare sau sisteme optice monocromatoare reglabile în lungime de undă pentru selectarea lungimilor de undă luminescente specifice. Abilitatea de a selecta mai multe lungimi de undă, sau chiar intervale de lungimi de undă, permite detectarea testelor care conțin mai multe enzime reporter luminescente, dezvoltarea de noi teste de luminescență, precum și un mijloc de optimizare a raportului semnal / zgomot.

Aplicațiile obișnuite includ teste de expresie genică bazate pe luciferază , precum și teste de viabilitate celulară, citotoxicitate și bioritm bazate pe detectarea luminiscentă a ATP .

Fluorescență rezolvată în timp (TRF)

Măsurarea fluorescenței rezolvate în timp (TRF) este foarte similară cu măsurarea intensității fluorescenței (FI). Singura diferență este momentul procesului de excitație / măsurare. La măsurarea FI, procesele de excitație și emisie sunt simultane: lumina emisă de probă este măsurată în timp ce are loc excitația. Chiar dacă sistemele de emisie sunt foarte eficiente la îndepărtarea luminii de excitație înainte de a ajunge la detector, cantitatea de lumină de excitație comparată cu lumina de emisie este de așa natură încât măsurătorile FI prezintă întotdeauna semnale de fundal destul de ridicate. TRF oferă o soluție la această problemă. Se bazează pe utilizarea unor molecule fluorescente foarte specifice, numite lantanide , care au proprietatea neobișnuită de a emite pe perioade lungi de timp (măsurate în milisecunde) după excitație, când majoritatea coloranților fluorescenți standard (de exemplu, fluoresceina) emit în câteva nanosecunde de a fi excitat. Ca rezultat, este posibil să se excite lantanidele folosind o sursă de lumină pulsată (lampă flash cu xenon sau laser pulsat, de exemplu) și să se măsoare după pulsul de excitație. Acest lucru are ca rezultat fundaluri de măsurare mai mici decât în ​​testele FI standard. Dezavantajele sunt că instrumentele și reactivii sunt de obicei mai scumpi și că aplicațiile trebuie să fie compatibile cu utilizarea acestor coloranți lantanidici foarte specifici. Principala utilizare a TRF se găsește în aplicațiile de screening pentru medicamente, sub un formular numit TR-FRET (transfer de energie fluorescentă rezolvată în timp). Testele TR- FRET sunt foarte robuste (sensibilitate limitată la mai multe tipuri de interferențe ale testului) și sunt ușor de miniaturizat. Robustitatea, capacitatea de a automatiza și miniaturiza sunt caracteristici extrem de atractive într-un laborator de screening.

Polarizarea fluorescenței

Măsurarea polarizării fluorescenței este, de asemenea, foarte aproape de detectarea FI. Diferența este că sistemul optic include filtre polarizante pe calea luminii: probele din microplacă sunt excitate folosind lumină polarizată (în loc de lumină nepolarizată în modurile FI și TRF). În funcție de mobilitatea moleculelor fluorescente găsite în puțuri, lumina emisă va fi fie polarizată, fie nu. De exemplu, moleculele mari (de exemplu, proteinele) în soluție, care se rotesc relativ lent din cauza dimensiunii lor, vor emite lumină polarizată atunci când sunt excitate cu lumină polarizată. Pe de altă parte, rotația rapidă a moleculelor mai mici va avea ca rezultat o depolarizare a semnalului. Sistemul de emisie al cititorului de plăci folosește filtre polarizante pentru a analiza polaritatea luminii emise. Un nivel scăzut de polarizare indică faptul că micile molecule fluorescente se mișcă liber în probă. Un nivel ridicat de polarizare indică faptul că fluorescența este atașată la un complex molecular mai mare. Ca rezultat, una dintre aplicațiile de bază ale detectării FP este testele de legare moleculară, deoarece acestea permit detectarea dacă o moleculă fluorescentă mică se leagă (sau nu) de o moleculă mai mare, non-fluorescentă: legarea are ca rezultat o viteză de rotație mai mică a moleculă fluorescentă și într-o creștere a polarizării semnalului.

Răspândirea luminii și nefelometria

Difuzarea luminii și nefelometria sunt metode pentru determinarea tulburării unei soluții (adică: particule insolubile într-o soluție). Un fascicul de lumină trece prin eșantion și lumina este împrăștiată de particulele suspendate. Lumina împrăștiată înainte măsurată indică cantitatea de particule insolubile prezente în soluție. Aplicațiile obișnuite de nefelometrie / împrăștiere a luminii includ screening automatizat al solubilității medicamentului HTS, cinetica de creștere microbiană pe termen lung, flocularea, agregarea și monitorizarea polimerizării și precipitațiilor, inclusiv imunoprecipitarea.

Instrumente și teste

Multe dintre modurile de detecție (absorbanță, intensitate fluorescentă, luminescență, fluorescență rezolvată în timp și polarizare fluorescentă) sunt disponibile în mod autonom în cititoare de plăci dedicate, dar se găsesc foarte des astăzi combinate într-un singur instrument (cititor de plăci multi-mod). Există, de asemenea, instrumente pentru măsurarea luminii dinamice sau statice împrăștiate din probe într-o microplacă. Gama de aplicații pentru cititoarele de plăci multi-mod este extrem de mare. Unele dintre cele mai frecvente teste sunt:

În timp ce „cititorul de plăci” se referă de obicei la dispozitivele descrise mai sus, sunt disponibile multe variante. Câteva exemple de alte dispozitive care funcționează cu formatul microplacă sunt:

  • Cititoare de plăci ELISPOT , utilizate pentru a număra petele colorate care se formează în cursul testelor ELISPOT.
  • Imagini cu randament ridicat care pot măsura simultan toate godeurile unei microplăci
  • Sisteme de screening cu conținut ridicat (HCS) care imaginează fiecare fântână cu rezoluție ridicată, pentru a privi populațiile celulare
  • Instrumente fără etichete care utilizează microplăci specializate pentru măsurarea evenimentelor de legare fără utilizarea markerilor chimici

Referințe