Leitor de placa - Plate reader

Os leitores de placa , também conhecidos como leitores de microplaca ou fotômetros de microplaca , são instrumentos usados ​​para detectar eventos biológicos , químicos ou físicos de amostras em placas de microtitulação . Eles são amplamente utilizados em pesquisa, descoberta de medicamentos , validação de bioensaios, controle de qualidade e processos de fabricação na indústria farmacêutica e biotecnológica e em organizações acadêmicas. As reações de amostra podem ser ensaiadas em placas de microtitulação de formato de 1-1536 poços. O formato de microplaca mais comum usado em laboratórios de pesquisa acadêmica ou laboratórios de diagnóstico clínico é de 96 poços (matriz de 8 por 12) com um volume de reação típico entre 100 e 200 µL por poço. Microplacas de alta densidade (microplacas de 384 ou 1536 poços) são normalmente usadas para aplicações de triagem, quando o rendimento (número de amostras por dia processadas) e o custo do ensaio por amostra se tornam parâmetros críticos, com um volume de ensaio típico entre 5 e 50 µL por poço . Os modos de detecção comuns para ensaios de microplaca são absorbância, intensidade de fluorescência , luminescência , fluorescência resolvida no tempo e polarização de fluorescência .

Métodos

Absorvância

A detecção de absorvância está disponível em leitores de microplaca há mais de 3 décadas e é usada para ensaios como ensaios ELISA , quantificação de proteínas e ácidos nucléicos ou ensaios de atividade enzimática (ou seja, no ensaio MTT para viabilidade celular). Uma fonte de luz ilumina a amostra usando um comprimento de onda específico (selecionado por um filtro óptico ou monocromador) e um detector de luz localizado do outro lado do poço mede quanto da luz inicial (100%) é transmitida através da amostra : a quantidade de luz transmitida normalmente estará relacionada à concentração da molécula de interesse. Diversas análises colorimétricas convencionais foram miniaturizadas para funcionar quantitativamente em um leitor de placas, com desempenho adequado para fins de pesquisa. Exemplos de análises convertidas em métodos de leitor de placas incluem vários para amônio , nitrato , nitrito , ureia , ferro (II) e ortofosfato . Produtos químicos colorimétricos mais recentes foram desenvolvidos diretamente para uso em leitores de placas.

Fluorescência

A detecção de intensidade de fluorescência se desenvolveu amplamente no formato de microplaca nas últimas duas décadas. A gama de aplicações é muito mais ampla do que ao usar a detecção de absorbância, mas a instrumentação geralmente é mais cara. Neste tipo de instrumentação, um primeiro sistema óptico (sistema de excitação) ilumina a amostra usando um comprimento de onda específico (selecionado por um filtro óptico ou monocromador). Como resultado da iluminação, a amostra emite luz (é fluorescente) e um segundo sistema óptico (sistema de emissão) coleta a luz emitida, separa-a da luz de excitação (usando um filtro ou sistema monocromador) e mede o sinal usando um detector de luz, como um tubo fotomultiplicador (PMT). As vantagens da detecção de fluorescência em relação à detecção de absorbância são a sensibilidade, bem como a faixa de aplicação, dada a ampla seleção de rótulos fluorescentes disponíveis atualmente. Por exemplo, uma técnica conhecida como imagem de cálcio mede a intensidade de fluorescência de corantes sensíveis ao cálcio para avaliar os níveis de cálcio intracelular.

Luminescência

A luminescência é o resultado de uma reação química ou bioquímica. A detecção de luminescência é opticamente mais simples do que a detecção de fluorescência porque a luminescência não requer uma fonte de luz para excitação ou óptica para selecionar comprimentos de onda de excitação discretos. Um sistema óptico de luminescência típico consiste em uma câmara de leitura à prova de luz e um detector PMT . Alguns leitores de placas usam um detector PMT analógico, enquanto outros têm um detector PMT de contagem de fótons . A contagem de fótons é amplamente aceita como o meio mais sensível de detecção de luminescência. Alguns leitores de placa oferecem roda de filtro ou sistemas ópticos de monocromador de comprimento de onda ajustável para selecionar comprimentos de onda luminescentes específicos. A capacidade de selecionar vários comprimentos de onda, ou mesmo intervalos de comprimento de onda, permite a detecção de ensaios que contêm várias enzimas repórter luminescentes, o desenvolvimento de novos ensaios de luminescência, bem como um meio de otimizar a relação sinal-ruído.

As aplicações comuns incluem ensaios de expressão gênica baseados em luciferase , bem como viabilidade celular, citotoxicidade e ensaios de biorritmo baseados na detecção luminescente de ATP .

Fluorescência resolvida no tempo (TRF)

A medição de fluorescência resolvida no tempo (TRF) é muito semelhante à medição de intensidade de fluorescência (FI). A única diferença é o tempo do processo de excitação / medição. Ao medir FI, os processos de excitação e emissão são simultâneos: a luz emitida pela amostra é medida durante a excitação. Mesmo que os sistemas de emissão sejam muito eficientes na remoção da luz de excitação antes de chegar ao detector, a quantidade de luz de excitação em comparação com a luz de emissão é tal que as medições de FI sempre exibem sinais de fundo bastante elevados. O TRF oferece uma solução para esse problema. Ele se baseia no uso de moléculas fluorescentes muito específicas, chamadas lantanídeos , que têm a propriedade incomum de emitir por longos períodos de tempo (medidos em milissegundos) após a excitação, quando a maioria dos corantes fluorescentes padrão (por exemplo, fluoresceína) emitem dentro de alguns nanossegundos de animado. Como resultado, é possível excitar lantanídeos usando uma fonte de luz pulsada (lâmpada de flash de xenônio ou laser pulsado, por exemplo) e medir após o pulso de excitação. Isso resulta em fundos de medição mais baixos do que em ensaios FI padrão. As desvantagens são que a instrumentação e os reagentes são normalmente mais caros e as aplicações devem ser compatíveis com o uso desses corantes lantanídeos muito específicos. O principal uso do TRF é encontrado em aplicações de triagem de drogas, sob uma forma chamada TR-FRET (transferência de energia de fluorescência resolvida no tempo). Os ensaios TR- FRET são muito robustos (sensibilidade limitada a vários tipos de interferência do ensaio) e são facilmente miniaturizados. Robustez, capacidade de automatizar e miniaturizar são características altamente atrativas em um laboratório de triagem.

Polarização de fluorescência

A medição de polarização de fluorescência também está muito próxima da detecção de FI. A diferença é que o sistema óptico inclui filtros de polarização no caminho da luz: as amostras na microplaca são excitadas com luz polarizada (em vez de luz não polarizada nos modos FI e TRF). Dependendo da mobilidade das moléculas fluorescentes encontradas nos poços, a luz emitida será polarizada ou não. Por exemplo, moléculas grandes (por exemplo, proteínas) em solução, que giram relativamente devagar devido ao seu tamanho, irão emitir luz polarizada quando excitadas com luz polarizada. Por outro lado, a rotação rápida de moléculas menores resultará em uma despolarização do sinal. O sistema de emissão do leitor de placas utiliza filtros polarizadores para analisar a polaridade da luz emitida. Um baixo nível de polarização indica que pequenas moléculas fluorescentes se movem livremente na amostra. Um alto nível de polarização indica que o fluorescente está ligado a um complexo molecular maior. Como resultado, uma das aplicações básicas da detecção de FP são os ensaios de ligação molecular, uma vez que permitem detectar se uma pequena molécula fluorescente se liga (ou não) a uma molécula não fluorescente maior: a ligação resulta em uma velocidade de rotação mais lenta do molécula fluorescente, e no aumento da polarização do sinal.

Espalhamento de luz e nefelometria

O espalhamento de luz e a nefelometria são métodos para a determinação da turvação de uma solução (ou seja: partículas insolúveis em uma solução). Um feixe de luz passa pela amostra e a luz é espalhada pelas partículas suspensas. A luz dispersa para a frente medida indica a quantidade de partículas insolúveis presentes na solução. Aplicações comuns de nefelometria / espalhamento de luz incluem triagem automatizada de solubilidade de drogas HTS, cinética de crescimento microbiano de longo prazo, floculação, agregação e monitoramento de polimerização e precipitação, incluindo imunoprecipitação.

Instrumentos e ensaios

Muitos dos modos de detecção (absorbância, intensidade de fluorescência, luminescência, fluorescência resolvida no tempo e polarização de fluorescência) estão disponíveis de forma independente em leitores de placa dedicados, mas são frequentemente encontrados hoje combinados em um único instrumento (leitor de placa multimodo). Existem também instrumentos para medir a luz dinâmica ou estática espalhada de amostras em uma microplaca. A gama de aplicações para leitores de placas multimodo é extremamente grande. Alguns dos ensaios mais comuns são:

Embora "leitor de placas" geralmente se refira aos dispositivos descritos acima, muitas variações estão disponíveis. Alguns exemplos de outros dispositivos que funcionam com o formato de microplaca são:

  • Leitores de placa ELISPOT , usados ​​para contar as manchas coloridas que são formadas no decurso dos ensaios ELISPOT.
  • Imageadores de alto rendimento que podem medir todos os poços de uma microplaca de uma vez
  • Sistemas de triagem de alto conteúdo (HCS) que geram imagens de cada poço com alta resolução, para observar as populações de células
  • Instrumentos sem etiqueta que usam microplacas especializadas para medir eventos de ligação sem o uso de marcadores químicos

Referências