Pyrosekvensering - Pyrosequencing

Pyrosekvensering er en metode for DNA-sekvensering (bestemmelse av rekkefølgen av nukleotider i DNA) basert på "sekvensering ved syntese" -prinsippet, der sekvenseringen utføres ved å påvise nukleotidet inkorporert av en DNA-polymerase . Pyrosekvensering er avhengig av lysdeteksjon basert på en kjedereaksjon når pyrofosfat frigjøres. Derfor navnet pyrosekvensering.

Prinsippet for Pyrosequencing ble først beskrevet i 1993 av Bertil Pettersson , Mathias Uhlen og Pål Nyren ved å kombinere fastfasesekvenseringsmetoden ved bruk av streptavidin- belagte magnetiske perler med rekombinant DNA-polymerase som mangler 3´ til 5´eksonukleaseaktivitet (korrekturlesing) og luminescensdeteksjon ved hjelp av firefly luciferase enzymet. En blanding av tre enzymer ( DNA polymerase , ATP sulfurylase og firefly luciferase ) og et nukleotid ( dNTP ) blir tilsatt til enkeltstrenget DNA som skal sekvenseres, og inkorporeringen av nukleotid følges ved å måle lyset som sendes ut. Lysintensiteten bestemmer om 0, 1 eller flere nukleotider er blitt innlemmet, og viser dermed hvor mange komplementære nukleotider som er tilstede på malstrengen. Nukleotidblandingen fjernes før neste nukleotidblanding tilsettes. Denne prosessen gjentas med hver av de fire nukleotidene til DNA-sekvensen til den enkeltstrengede malen er bestemt.

En annen løsningsbasert metode for Pyrosequencing ble beskrevet i 1998 av Mostafa Ronaghi , Mathias Uhlen og Pål Nyren . I denne alternative metoden introduseres et ekstra enzymapyrase for å fjerne nukleotider som ikke er inkorporert av DNA-polymerasen. Dette muliggjorde at enzymblandingen inkludert DNA-polymerase , luciferase og apyrase ble tilsatt i starten og oppbevart gjennom hele prosedyren, og gir dermed en enkel oppsett som er egnet for automatisering. Et automatisert instrument basert på dette prinsippet ble introdusert på markedet året etter av selskapet Pyrosequencing.

En tredje mikrofluidisk variant av Pyrosequencing-metoden ble beskrevet i 2005 av Jonathan Rothberg og medarbeidere i selskapet 454 Life Sciences . Denne alternative tilnærmingen for Pyrosequencing var basert på det opprinnelige prinsippet om å feste DNA som skal sekvenseres til en solid støtte, og de viste at sekvensering kunne utføres på en svært parallell måte ved bruk av en mikrofabrikert mikroarray . Dette åpnet for DNA-sekvensering med høy gjennomstrømning, og et automatisert instrument ble introdusert til markedet. Dette ble det første neste generasjons sekvenseringsinstrument som startet en ny æra innen genomforskning , med raskt fallende priser for DNA-sekvensering som tillater hele genom-sekvensering til rimelige priser.

Fremgangsmåte

Hvordan Pyrosequencing fungerer
Diagrammet viser hvordan pyrosekvensering fungerer.

"Sekvensering ved syntese" innebærer å ta en enkelt streng av DNA som skal sekvenseres og deretter syntetisere dens komplementære streng enzymatisk. Pyrosekvenseringsmetoden er basert på å påvise aktiviteten til DNA-polymerase (et DNA-syntetiserende enzym) med et annet kjemoluminescerende enzym . I hovedsak tillater metoden sekvensering av en enkelt DNA- streng ved å syntetisere den komplementære strengen langs den, ett basepar om gangen, og oppdage hvilken base som faktisk ble tilsatt ved hvert trinn. Mal-DNA er immobile, og oppløsninger av A-, C-, G- og T- nukleotider tilsettes sekvensielt og fjernes fra reaksjonen. Lys produseres bare når nukleotidløsningen utfyller den første uparede basen i malen. Sekvensen av løsninger som produserer kjemiluminescerende signaler tillater bestemmelse av malets sekvens.

For den løsningsbaserte versjon av pyrosekvensering, den enkelttrådet DNA ( ssDNA ) malen blir hybridisert til en sekvenseringsprimeren og inkubert med enzymer DNA-polymerase , ATP sulfurylase , luciferase og apyrase , og med den substrater adenosin 5'phosphosulfate (APS) og luciferin .

  1. Tilsetningen av en av de fire deoksynukleotidtrifosfatene ( dNTPs ) (dATPαS, som ikke er et substrat for en luciferase, tilsettes i stedet for dATP for å unngå støy) starter det andre trinnet. DNA-polymerase inkorporerer de riktige, komplementære dNTP-ene på malen. Denne innlemmelsen frigjør pyrofosfat (PPi).
  2. ATP sulfurylase konverterer PPi til ATP i nærvær av adenosin 5´ fosfosulfat. Denne ATP fungerer som et substrat for den luciferasemedierte omdannelsen av luciferin til oksyluciferin som genererer synlig lys i mengder som er proporsjonale med mengden. Lyset som produseres i den luciferase-katalyserte reaksjonen blir oppdaget av et kamera og analysert i et program.
  3. Ikke-inkorporerte nukleotider og ATP nedbrytes av apyrasen , og reaksjonen kan starte på nytt med et annet nukleotid.

Prosessen kan representeres av følgende ligninger:

  • PPi + APS → ATP + sulfat (katalysert av ATP-sulfurylase);
  • ATP + luciferin + O2 → AMP + PPi + oksyluciferin + CO2 + hv (katalysert av luciferase);

hvor:

  • PPi er pyrofosfat
  • APS er adenosin-5-fosfosulfat;
  • ATP er adenosintrifosfat;
  • O2 er oksygenmolekyl;
  • AMP er adenosinmonofosfat;
  • CO2 er karbondioksid;
  • hv er lett.

Begrensninger

For tiden er en begrensning av metoden at lengdene på individuelle avlesninger av DNA-sekvenser er i nærheten av 300-500 nukleotider, kortere enn 800-1000 som kan oppnås med kjedetermineringsmetoder (f.eks. Sanger-sekvensering). Dette kan gjøre prosessen med genommontering vanskeligere, spesielt for sekvenser som inneholder en stor mengde repeterende DNA . Mangel på korrekturaktivitet begrenser nøyaktigheten til denne metoden.

Kommersialisering

Selskapet Pyrosequencing AB i Uppsala, Sverige ble grunnlagt med risikokapital levert av HealthCap for å kommersialisere maskiner og reagenser for sekvensering av korte DNA-strekninger ved hjelp av pyrosekvenseringsteknikken. Pyrosequencing AB ble notert på Stockholmsbørsen i 1999. Det ble omdøpt til Biotage i 2003. Virksomhetsområdet pyrosequencing ble kjøpt opp av Qiagen i 2008. Pyrosequencing-teknologi ble videre lisensiert til 454 Life Sciences . 454 utviklet en array-basert pyrosekvenseringsteknologi som dukket opp som en plattform for storskala DNA-sekvensering , inkludert genom-sekvensering og metagenomics .

Roche kunngjorde avviklingen av 454-sekvenseringsplattformen i 2013 da teknologien ble konkurransedyktig.

Referanser

Videre lesning