Pyroséquençage - Pyrosequencing

Le pyroséquençage est une méthode de séquençage d'ADN (détermination de l'ordre des nucléotides dans l'ADN) basée sur le principe du «séquençage par synthèse», dans laquelle le séquençage est réalisé en détectant le nucléotide incorporé par une ADN polymérase . Le pyroséquençage repose sur la détection de la lumière basée sur une réaction en chaîne lorsque du pyrophosphate est libéré. D'où le nom pyroséquençage.

Le principe du pyroséquençage a été décrit pour la première fois en 1993 par Bertil Pettersson , Mathias Uhlen et Pål Nyren en combinant la méthode de séquençage en phase solide utilisant des billes magnétiques recouvertes de streptavidine avec de l'ADN polymérase recombinante dépourvue d'activité d'exonucléase 3 'à 5' (relecture) et de détection de luminescence en utilisant l' enzyme luciférase de luciole . Un mélange de trois enzymes ( ADN polymérase , ATP sulfurylase et luciférase de luciole ) et d'un nucléotide ( dNTP ) sont ajoutés à l'ADN simple brin à séquencer et l'incorporation du nucléotide est suivie de la mesure de la lumière émise. L'intensité de la lumière détermine si 0, 1 ou plusieurs nucléotides ont été incorporés, montrant ainsi combien de nucléotides complémentaires sont présents sur le brin matrice. Le mélange nucléotidique est éliminé avant l'ajout du mélange nucléotidique suivant. Ce processus est répété avec chacun des quatre nucléotides jusqu'à ce que la séquence d'ADN de la matrice monocaténaire soit déterminée.

Une deuxième méthode de pyroséquençage basée sur des solutions a été décrite en 1998 par Mostafa Ronaghi , Mathias Uhlen et Pål Nyren . Dans cette méthode alternative, une enzyme apyrase supplémentaire est introduite pour éliminer les nucléotides qui ne sont pas incorporés par l'ADN polymérase. Cela a permis au mélange d'enzymes comprenant l' ADN polymérase , la luciférase et l' apyrase d'être ajouté au début et conservé tout au long de la procédure, fournissant ainsi une configuration simple adaptée à l'automatisation. Un instrument automatisé basé sur ce principe a été introduit sur le marché l'année suivante par la société Pyrosequencing.

Une troisième variante microfluidique de la méthode de pyroséquençage a été décrite en 2005 par Jonathan Rothberg et ses collaborateurs de la société 454 Life Sciences . Cette approche alternative pour le pyroséquençage était basée sur le principe original de la fixation de l'ADN à séquencer à un support solide et ils ont montré que le séquençage pouvait être effectué de manière très parallèle à l'aide d'un microréseau microfabriqué . Cela a permis un séquençage d'ADN à haut débit et un instrument automatisé a été introduit sur le marché. Il s'agit du premier instrument de séquençage de nouvelle génération qui ouvre une nouvelle ère dans la recherche en génomique , avec une baisse rapide des prix du séquençage d'ADN permettant le séquençage du génome entier à des prix abordables.

Procédure

Comment fonctionne le pyroséquençage
Le graphique montre comment fonctionne le pyroséquençage.

Le «séquençage par synthèse» consiste à prélever un seul brin de l'ADN à séquencer puis à synthétiser son brin complémentaire par voie enzymatique. La méthode de pyroséquençage est basée sur la détection de l'activité de l' ADN polymérase (une enzyme de synthèse d'ADN) avec une autre enzyme chimioluminescente . Essentiellement, le procédé permet de séquencer un seul brin d' ADN en synthétisant le brin complémentaire le long de celui-ci, une paire de bases à la fois, et en détectant quelle base a été réellement ajoutée à chaque étape. L'ADN matrice est immobile et des solutions de nucléotides A, C, G et T sont séquentiellement ajoutées et éliminées de la réaction. La lumière n'est produite que lorsque la solution nucléotidique complète la première base non appariée de la matrice. La séquence de solutions qui produisent des signaux chimioluminescents permet la détermination de la séquence de la matrice.

Pour la version en solution du pyroséquençage, la matrice d'ADN simple brin ( ADNsb ) est hybridée à une amorce de séquençage et incubée avec les enzymes ADN polymérase , ATP sulfurylase , luciférase et apyrase , et avec les substrats adénosine 5´ phosphosulfate (APS) et la luciférine .

  1. L'ajout de l'un des quatre désoxynucléotides triphosphates ( dNTP ) (dATPαS, qui n'est pas un substrat pour une luciférase, est ajouté à la place du dATP pour éviter le bruit) lance la deuxième étape. L'ADN polymérase incorpore les dNTP complémentaires corrects sur la matrice. Cette incorporation libère du pyrophosphate (PPi).
  2. L'ATP sulfurylase convertit le PPi en ATP en présence d'adénosine 5´ phosphosulfate. Cet ATP agit comme un substrat pour la conversion médiée par la luciférase de la luciférine en oxyluciférine qui génère de la lumière visible en quantités proportionnelles à la quantité. La lumière produite dans la réaction catalysée par la luciférase est détectée par une caméra et analysée dans un programme.
  3. Les nucléotides non incorporés et l'ATP sont dégradés par l' apyrase et la réaction peut redémarrer avec un autre nucléotide.

Le processus peut être représenté par les équations suivantes:

  • PPi + APS → ATP + Sulfate (catalysé par l'ATP-sulfurylase);
  • ATP + luciférine + O2 → AMP + PPi + oxyluciférine + CO2 + hv (catalysé par la luciférase);

où:

  • PPi est le pyrophosphate
  • APS est l'adénosine 5-phosphosulfate;
  • L'ATP est l'adénosine triphosphate;
  • O2 est une molécule d'oxygène;
  • AMP est l'adénosine monophosphate;
  • Le CO2 est du dioxyde de carbone;
  • hv est léger.

Limites

Actuellement, une limitation de la méthode est que les longueurs des lectures individuelles de la séquence d'ADN sont au voisinage de 300-500 nucléotides, plus courtes que les 800-1000 pouvant être obtenues avec les méthodes de terminaison de chaîne (par exemple le séquençage de Sanger). Cela peut rendre le processus d' assemblage du génome plus difficile, en particulier pour les séquences contenant une grande quantité d' ADN répétitif . Le manque d'activité de relecture limite l'exactitude de cette méthode.

Commercialisation

La société Pyrosequencing AB à Uppsala, en Suède, a été fondée avec du capital-risque fourni par HealthCap afin de commercialiser des machines et des réactifs pour le séquençage de courtes portions d'ADN à l'aide de la technique de pyroséquençage. Pyroséquençage AB a été coté à la Bourse de Stockholm en 1999. Il a été rebaptisé Biotage en 2003. La ligne d'activité pyroséquençage a été acquise par Qiagen en 2008. La technologie de pyroséquençage a été en outre licenciée à 454 Life Sciences . 454 a développé une technologie de pyroséquençage basée sur un réseau qui a émergé comme une plate-forme pour le séquençage d'ADN à grande échelle , y compris le séquençage du génome et la métagénomique .

Roche a annoncé l'arrêt de la plate-forme de séquençage 454 en 2013 lorsque sa technologie est devenue non compétitive.

Les références

Lectures complémentaires