Protein mikroarray - Protein microarray

En proteinmikroarray (eller proteinbrikke ) er en metode med høy gjennomstrømning som brukes til å spore interaksjoner og aktiviteter til proteiner, og for å bestemme deres funksjon og bestemme funksjon i stor skala. Den største fordelen ligger i det faktum at et stort antall proteiner kan spores parallelt. Brikken består av en støtteoverflate som et glassglass, nitrocellulosemembran, perle eller mikrotiterplate , som en rekke fangstproteiner er bundet til. Sondemolekyler , vanligvis merket med et fluorescerende fargestoff, legges til i matrisen. Enhver reaksjon mellom sonden og det immobiliserte proteinet avgir et fluorescerende signal som leses av en laserskanner . Proteinmikroarrays er raske, automatiserte, økonomiske og svært følsomme og bruker små mengder prøver og reagenser. Konseptet og metodikken for proteinmikroarrays ble først introdusert og illustrert i antistoffmikroarrayer (også referert til som antistoffmatrise ) i 1983 i en vitenskapelig publikasjon og en serie patenter. High-throughput-teknologien bak proteinmikroarrayet var relativt enkel å utvikle siden den er basert på teknologien utviklet for DNA-mikroarrayer , som har blitt de mest brukte mikroarrayene .

Motivasjon for utvikling

Proteinmikroarrays ble utviklet på grunn av begrensningene ved bruk av DNA -mikroarrays for å bestemme genuttrykksnivåer i proteomikk . Mengden mRNA i cellen gjenspeiler ofte ikke ekspresjonsnivåene til proteinene de tilsvarer. Siden det vanligvis er proteinet, snarere enn mRNA, som har den funksjonelle rollen i cellerespons, var en ny tilnærming nødvendig. I tillegg er posttranslasjonelle modifikasjoner , som ofte er kritiske for å bestemme proteinfunksjon, ikke synlige på DNA-mikroarrays. Proteinmikroarrays erstatter tradisjonelle proteomikk-teknikker som 2D gelelektroforese eller kromatografi , som var tidkrevende, arbeidskrevende og lite egnet for analyse av proteiner med lavt omfang.

Å lage matrisen

Proteinene er lagt på en fast overflate, for eksempel objektglass, membraner, perler eller mikrotiterplater. Funksjonen til denne overflaten er å gi en støtte som proteiner kan immobiliseres på. Det skal demonstrere maksimale bindingsegenskaper, samtidig som proteinet opprettholdes i sin opprinnelige form, slik at dets bindingsevne beholdes. Mikroskopglass av glass eller silisium er et populært valg siden de er kompatible med lett oppnådde robotarrayere og laserskannere som er utviklet for DNA -mikroarray -teknologi. Nitrocellulosefilmbilder er bredt akseptert som det høyeste proteinbindende substratet for proteinmikroarray -applikasjoner.

Den valgte faste overflaten blir deretter dekket med et belegg som må tjene de samtidige funksjonene med å immobilisere proteinet, forhindre denaturering , orientere det i riktig retning slik at bindingsstedene er tilgjengelige, og gi et hydrofilt miljø der bindingsreaksjonen kan skje. Den må også vise minimal uspesifikk binding for å minimere bakgrunnsstøy i deteksjonssystemene. Videre må den være kompatibel med forskjellige deteksjonssystemer. Immobiliseringsmidler inkluderer lag av aluminium eller gull, hydrofile polymerer og polyakrylamidgeler , eller behandling med aminer , aldehyd eller epoksy . Tynnfilmsteknologi som fysisk dampavsetning (PVD) og kjemisk dampavsetning (CVD) brukes for å påføre belegget på støtteoverflaten.

Et vandig miljø er avgjørende i alle stadier av matriseproduksjon og drift for å forhindre proteindaturering. Derfor inneholder prøvebuffere en høy prosent glyserol (for å senke frysepunktet), og fuktigheten i produksjonsmiljøet er nøye regulert. Mikrobølgeovn har den doble fordelen av å gi et vandig miljø samtidig som det forhindrer krysskontaminering mellom prøver.

I den vanligste typen proteinsortiment plasserer roboter et stort antall proteiner eller deres ligander på en belagt fast bærer i et forhåndsdefinert mønster. Dette er kjent som robotkontaktutskrift eller robotflekker. En annen fremstillingsmetode er blekkstråling , en drop-on-demand, berøringsfri metode for å dispergere proteinpolymerene på den faste overflaten i ønsket mønster. Piezoelektrisk spotting er en lignende metode som blekkstråleutskrift. Skrivehodet beveger seg over matrisen, og bruker hvert sted elektrisk stimulering for å levere proteinmolekylene til overflaten via små stråler. Dette er også en kontaktfri prosess. Fotolitografi er en fjerde metode for å legge proteinene på overflaten. Lys brukes i forbindelse med fotomasker , ugjennomsiktige plater med hull eller transparenter som lar lys skinne gjennom i et definert mønster. En rekke kjemiske behandlinger muliggjør deretter avsetning av proteinet i ønsket mønster på materialet under fotomasken.

Fangstmolekylene som er plassert på den faste overflaten kan være antistoffer , antigener , aptamerer (nukleinsyrebaserte ligander), affibistoffer (små molekyler konstruert for å etterligne monoklonale antistoffer) eller proteiner i full lengde. Kilder til slike proteiner inkluderer cellebaserte ekspresjonssystemer for rekombinante proteiner , rensing fra naturlige kilder, produksjon in vitro ved cellefrie oversettelsessystemer og syntetiske metoder for peptider . Mange av disse metodene kan automatiseres for produksjon med høy gjennomstrømning, men det må utvises forsiktighet for å unngå synteseforhold eller ekstraksjon som resulterer i et denaturert protein som, siden det ikke lenger gjenkjenner sin bindingspartner, gjør gruppen ubrukelig.

Proteiner er svært følsomme for endringer i mikromiljøet. Dette gir en utfordring i å opprettholde proteiner i en stabil tilstand over lengre tid. In situ- metoder-oppfunnet og publisert av Mingyue He og Michael Taussig i 2001-involverer på-chip-syntese av proteiner etter behov, direkte fra DNA ved bruk av cellefrie proteinuttrykkssystemer. Siden DNA er et svært stabilt molekyl, forringes det ikke over tid og er derfor egnet til langtidsoppbevaring. Denne tilnærmingen er også fordelaktig ved at den omgår de møysommelige og ofte kostbare prosessene med separat proteinrensing og DNA -kloning , siden proteiner lages og immobiliseres samtidig i et enkelt trinn på flisoverflaten. Eksempler på in situ -teknikker er PISA (protein in situ array), NAPPA (nukleinsyre programmerbar protein array) og DAPA (DNA array til protein array).

Typer matriser

Det er tre typer proteinmikroarrays som for tiden brukes til å studere de biokjemiske aktivitetene til proteiner.

Analytiske mikroarrays er også kjent som capture arrays. I denne teknikken er et bibliotek med antistoffer, aptamerer eller affibodies sammensatt på støtteoverflaten. Disse brukes som fangstmolekyler siden hver binder seg spesifikt til et bestemt protein. Arrayen er sonderet med en kompleks proteinløsning som et cellelysat . Analyse av de resulterende bindingsreaksjonene ved bruk av forskjellige deteksjonssystemer kan gi informasjon om ekspresjonsnivåer for bestemte proteiner i prøven, samt målinger av bindingsaffiniteter og -spesifisiteter. Denne typen mikroarray er spesielt nyttig for å sammenligne proteinuttrykk i forskjellige løsninger. For eksempel kan cellens respons på en bestemt faktor identifiseres ved å sammenligne lysatene til celler behandlet med spesifikke stoffer eller vokst under visse betingelser med lysatene til kontrollceller. En annen applikasjon er identifisering og profilering av syke vev.

Omvendtfase proteinmikroarray (RPPA) involverer komplekse prøver, for eksempel vevslysater. Celler isoleres fra forskjellige vev av interesse og lyseres. Lysatet er gruppert på mikroarrayet og sonderet med antistoffer mot målproteinet av interesse. Disse antistoffene blir vanligvis påvist med kjemiluminescerende , fluorescerende eller kolorimetriske analyser. Referansepeptider skrives ut på lysbildene for å tillate proteinkvantifisering av prøvelysatene. RPAs tillater bestemmelse av tilstedeværelsen av endrede proteiner eller andre midler som kan være et resultat av sykdom. Spesielt kan posttranslasjonelle modifikasjoner, som vanligvis endres som følge av sykdom, oppdages ved bruk av RPA.

Funksjonelle proteiner mikroarrays

Funksjonelle proteinmikroarrays (også kjent som målprotein-matriser) er konstruert ved å immobilisere et stort antall rensede proteiner og brukes til å identifisere interaksjoner mellom protein-protein, protein-DNA, protein- RNA , protein- fosfolipid og protein-små-molekyler, for å analysere enzymatisk aktivitet og for å påvise antistoffer og demonstrere deres spesifisitet. De skiller seg fra analytiske matriser ved at funksjonelle proteinarrayer er sammensatt av matriser som inneholder funksjonelle proteiner eller proteindomener i full lengde. Disse proteinflisene brukes til å studere de biokjemiske aktivitetene til hele proteomet i et enkelt eksperiment.

Nøkkelelementet i alle funksjonelle proteinmikroarraybaserte analyser er at de grupperte proteinene må beholde sin opprinnelige struktur, slik at meningsfulle funksjonelle interaksjoner kan finne sted på matrisens overflate. Fordelene med å kontrollere den nøyaktige måten å feste overflaten ved bruk av en passende affinitetskode er at de immobiliserte proteinene vil ha en homogen orientering som resulterer i en høyere spesifikk aktivitet og høyere signal-til-støy-forhold i analyser, med mindre interferens fra ikke- spesifikke interaksjoner.

Gjenkjenning

Proteinarray -deteksjonsmetoder må gi et høyt signal og en lav bakgrunn. Den vanligste og mest brukte metoden for deteksjon er fluorescensmerking som er svært sensitiv, trygg og kompatibel med lett tilgjengelige mikroarrayslaserskannere. Andre etiketter kan brukes, for eksempel affinitets-, fotokjemiske eller radioisotopmerker. Disse merkene er festet til selve proben og kan forstyrre sonde-målproteinreaksjonen. Derfor er en rekke etikettfrie deteksjonsmetoder tilgjengelig, for eksempel overflate plasmonresonans (SPR), karbon nanorør, karbon nanotråd sensorer (hvor deteksjon skjer via endringer i konduktans) og mikroelektromekanisk system (MEMS) cantilevers. Alle disse etikettfrie deteksjonsmetodene er relativt nye og er ennå ikke egnet for deteksjon av proteininteraksjon med høy gjennomstrømning; de gir imidlertid mye løfte for fremtiden. Immunanalyser på tiol-en "syntetisk papir" mikropillar stillaser har vist å generere et overlegen fluorescenssignal.

Proteinkvantifisering på nitrocellulose-belagte glassglass kan bruke nær-IR fluorescerende deteksjon. Dette begrenser forstyrrelser på grunn av auto-fluorescens av nitrocellulosen ved UV-bølgelengdene som brukes for standard fluorescerende deteksjonsonder.

applikasjoner

Det er fem hovedområder der proteinoppsett brukes: diagnostikk, proteomikk, proteinfunksjonell analyse, antistoffkarakterisering og behandlingsutvikling.

Diagnostikk innebærer påvisning av antigener og antistoffer i blodprøver; den profilering av sera for å oppdage nye sykdoms biomarkører ; overvåking av sykdomstilstander og reaksjoner på terapi i personlig medisin; overvåking av miljø og mat. Digital bioassay er et eksempel på bruk av proteinmikroarray til diagnostiske formål. I denne teknologien er en rekke mikrobrønner på en glass-/polymerbrikke seedet med magnetiske perler (belagt med fluorescerende merkede antistoffer), utsatt for målrettede antigener og deretter preget av et mikroskop gjennom telling av fluorescerende brønner. En kostnadseffektiv fabrikasjonsplattform (ved bruk av OSTE-polymerer ) for slike mikrobrønnarrayer har nylig blitt demonstrert og bio-analysemodellsystemet har blitt vellykket karakterisert.

Proteomics gjelder proteinuttrykksprofilering, dvs. hvilke proteiner som uttrykkes i lysatet av en bestemt celle.

Proteinfunksjonell analyse er identifikasjon av protein -protein -interaksjoner (f.eks. Identifisering av medlemmer av et proteinkompleks), protein -fosfolipid -interaksjoner, små molekylmål, enzymatiske substrater (spesielt kinaser -substrater ) og reseptorligander.

Antistoffkarakterisering karakteriserer kryssreaktivitet , spesifisitet og kartlegging av epitoper .

Behandlingsutvikling innebærer utvikling av antigenspesifikke behandlinger for autoimmunitet , kreft og allergi; identifisering av små molekylmål som potensielt kan brukes som nye legemidler.

Utfordringer

Til tross for de store investeringene som er gjort av flere selskaper, har proteiner chips ennå ikke oversvømmet markedet. Produsenter har funnet ut at proteiner faktisk er ganske vanskelige å håndtere. Produksjon av pålitelige, konsistente proteiner med høy gjennomstrømning som er korrekt brettet og funksjonell, er beheftet med vanskeligheter, da de ofte resulterer i lavt utbytte av proteiner på grunn av redusert løselighet og dannelse av inkluderingslegemer. En proteinbrikke krever mange flere trinn i opprettelsen enn en DNA -brikke .

Det er en rekke tilnærminger til dette problemet som er fundamentalt forskjellige i forhold til om proteinene er immobilisert gjennom uspesifikke, dårlig definerte interaksjoner eller gjennom et bestemt sett med kjente interaksjoner. Den tidligere tilnærmingen er attraktiv i sin enkelhet og er kompatibel med rensede proteiner avledet fra native eller rekombinante kilder, men lider av en rekke risikoer. Mest bemerkelsesverdig blant disse er den ukontrollerte naturen til interaksjonene mellom hvert protein og overflaten; i beste fall kan dette gi opphav til en heterogen populasjon av proteiner der aktive steder noen ganger er tilstoppet av overflaten; i verste fall kan det ødelegge aktivitet helt på grunn av delvis eller fullstendig overflatemediert utfoldelse av det immobiliserte proteinet.

Utfordringer inkluderer: 1) å finne en overflate og en festemetode som gjør at proteinene kan opprettholde sin sekundære eller tertiære struktur og dermed deres biologiske aktivitet og deres interaksjoner med andre molekyler, 2) å produsere en matrise med lang holdbarhet slik at proteinene på brikken ikke denaturere over kort tid, 3) identifisere og isolere antistoffer eller andre fangstmolekyler mot hvert protein i det humane genomet, 4) kvantifisere nivåene av bundet protein samtidig som følsomhet og unngå bakgrunnsstøy, 5) ekstraheres det detekterte protein fra brikken for å kunne analysere den ytterligere, 6) redusere uspesifikk binding av fangstmidlene, 7) brikkens kapasitet må være tilstrekkelig til at en så fullstendig representasjon av proteomet kan visualiseres som mulig; rike proteiner overvelder påvisning av mindre store proteiner som signalmolekyler og reseptorer, som generelt er av mer terapeutisk interesse.

Se også

• Microarray -avtrykk og mønster for overflatenergi
• Etikettfri deteksjonsteknikk for proteinmikroarrays

Referanser