Microarray proteico - Protein microarray

Un microarray proteico (o chip proteico ) è un metodo ad alto rendimento utilizzato per tracciare le interazioni e le attività delle proteine, determinarne la funzione e determinarne la funzione su larga scala. Il suo principale vantaggio risiede nel fatto che un gran numero di proteine ​​può essere tracciato in parallelo. Il chip è costituito da una superficie di supporto come un vetrino, una membrana di nitrocellulosa, una perlina o una piastra per microtitolazione , a cui è legata una serie di proteine ​​di cattura. Le molecole della sonda , tipicamente etichettate con un colorante fluorescente, vengono aggiunte all'array. Qualsiasi reazione tra la sonda e la proteina immobilizzata emette un segnale fluorescente che viene letto da uno scanner laser . I microarray proteici sono rapidi, automatizzati, economici e altamente sensibili, poiché consumano piccole quantità di campioni e reagenti. Il concetto e la metodologia dei microarray proteici sono stati introdotti e illustrati per la prima volta nei microarray anticorpali (noti anche come matrice anticorpale ) nel 1983 in una pubblicazione scientifica e in una serie di brevetti. La tecnologia ad alto rendimento alla base del microarray proteico è stata relativamente facile da sviluppare poiché si basa sulla tecnologia sviluppata per i microarray del DNA , che sono diventati i microarray più utilizzati .

Motivazione per lo sviluppo

I microarray proteici sono stati sviluppati a causa dei limiti dell'utilizzo dei microarray di DNA per determinare i livelli di espressione genica nella proteomica . La quantità di mRNA nella cellula spesso non riflette i livelli di espressione delle proteine ​​a cui corrispondono. Poiché di solito è la proteina, piuttosto che l'mRNA, ad avere il ruolo funzionale nella risposta cellulare, era necessario un nuovo approccio. Inoltre le modifiche post-traduzionali , che sono spesso critiche per determinare la funzione delle proteine, non sono visibili sui microarray di DNA. I microarray proteici sostituiscono le tradizionali tecniche di proteomica come l'elettroforesi su gel 2D o la cromatografia , che richiedevano molto tempo, richiedevano molta manodopera e non erano adatte per l'analisi di proteine ​​poco abbondanti.

Fare l'array

Le proteine ​​sono disposte su una superficie solida come vetrini per microscopio, membrane, perline o piastre per microtitolazione. La funzione di questa superficie è quella di fornire un supporto su cui immobilizzare le proteine. Dovrebbe dimostrare le massime proprietà di legame, pur mantenendo la proteina nella sua conformazione nativa in modo che la sua capacità di legame sia mantenuta. I vetrini per microscopio in vetro o silicio sono una scelta popolare poiché sono compatibili con gli array robotici e gli scanner laser facilmente ottenibili che sono stati sviluppati per la tecnologia dei microarray di DNA. I vetrini in pellicola di nitrocellulosa sono ampiamente accettati come il substrato con il più alto legame proteico per le applicazioni di microarray proteici.

La superficie solida prescelta viene quindi ricoperta da un rivestimento che deve svolgere le funzioni simultanee di immobilizzare la proteina, prevenirne la denaturazione , orientarla nella direzione appropriata in modo che i suoi siti di legame siano accessibili e fornire un ambiente idrofilo in cui la reazione di legame possa verificarsi. Deve inoltre visualizzare un'associazione non specifica minima per ridurre al minimo il rumore di fondo nei sistemi di rilevamento. Inoltre, deve essere compatibile con diversi sistemi di rilevamento. Gli agenti immobilizzanti includono strati di alluminio o oro, polimeri idrofili e gel di poliacrilammide o trattamenti con ammine , aldeide o resina epossidica . Le tecnologie a film sottile come la deposizione fisica da vapore (PVD) e la deposizione chimica da vapore (CVD) sono impiegate per applicare il rivestimento alla superficie di supporto.

Un ambiente acquoso è essenziale in tutte le fasi della produzione e del funzionamento dell'array per prevenire la denaturazione delle proteine. Pertanto, i tamponi per campioni contengono un'alta percentuale di glicerolo (per abbassare il punto di congelamento) e l'umidità dell'ambiente di produzione è regolata con cura. I micropozzetti hanno il duplice vantaggio di fornire un ambiente acquoso prevenendo la contaminazione incrociata tra i campioni.

Nel tipo più comune di matrice proteica, i robot posizionano un gran numero di proteine ​​o dei loro ligandi su un supporto solido rivestito in uno schema predefinito. Questo è noto come stampa a contatto robotica o spotting robotico. Un altro metodo di fabbricazione è il getto d'inchiostro , un metodo drop-on-demand senza contatto per disperdere i polimeri proteici sulla superficie solida nel modello desiderato. Lo spotting piezoelettrico è un metodo simile alla stampa a getto d'inchiostro. La testina di stampa si sposta attraverso l'array e in ogni punto utilizza la stimolazione elettrica per fornire le molecole proteiche sulla superficie tramite piccoli getti. Anche questo è un processo senza contatto. La fotolitografia è un quarto metodo per disporre le proteine ​​sulla superficie. La luce viene utilizzata in associazione con fotomaschere , lastre opache con fori o trasparenze che consentono alla luce di trasparire secondo uno schema definito. Una serie di trattamenti chimici consente quindi la deposizione della proteina nel modello desiderato sul materiale al di sotto della fotomaschera.

Le molecole di cattura disposte sulla superficie solida possono essere anticorpi , antigeni , aptameri (leganti a base di acidi nucleici), affibodies (piccole molecole ingegnerizzate per imitare gli anticorpi monoclonali) o proteine ​​a lunghezza intera. Le fonti di tali proteine ​​includono sistemi di espressione basati su cellule per proteine ​​ricombinanti , purificazione da fonti naturali, produzione in vitro mediante sistemi di traduzione senza cellule e metodi sintetici per peptidi . Molti di questi metodi possono essere automatizzati per la produzione ad alto rendimento, ma occorre prestare attenzione per evitare condizioni di sintesi o estrazione che si traducano in una proteina denaturata che, poiché non riconosce più il suo partner di legame, rende inutile l'array.

Le proteine ​​sono molto sensibili ai cambiamenti nel loro microambiente. Ciò rappresenta una sfida nel mantenere gli array proteici in condizioni stabili per lunghi periodi di tempo. I metodi in situ - inventati e pubblicati da Mingyue He e Michael Taussig nel 2001 - comportano la sintesi su chip di proteine ​​come e quando richiesto, direttamente dal DNA utilizzando sistemi di espressione proteica privi di cellule. Poiché il DNA è una molecola altamente stabile, non si deteriora nel tempo ed è quindi adatto alla conservazione a lungo termine. Questo approccio è anche vantaggioso in quanto elude i laboriosi e spesso costosi processi di purificazione separata delle proteine ​​e di clonazione del DNA , poiché le proteine ​​vengono prodotte e immobilizzate simultaneamente in un unico passaggio sulla superficie del chip. Esempi di tecniche in situ sono PISA (array di proteine ​​in situ), NAPPA (array di proteine ​​programmabili di acido nucleico) e DAPA (array di DNA a array di proteine).

Tipi di array

Esistono tre tipi di microarray proteici attualmente utilizzati per studiare le attività biochimiche delle proteine.

I microarray analitici sono anche noti come array di cattura. In questa tecnica, una libreria di anticorpi, aptameri o affibodies è disposta sulla superficie di supporto. Questi sono usati come molecole di cattura poiché ciascuna si lega specificamente a una particolare proteina. L'array viene sondato con una soluzione proteica complessa come un lisato cellulare . L'analisi delle reazioni di legame risultanti utilizzando vari sistemi di rilevamento può fornire informazioni sui livelli di espressione di particolari proteine ​​nel campione, nonché misurazioni di affinità e specificità di legame. Questo tipo di microarray è particolarmente utile per confrontare l'espressione proteica in diverse soluzioni. Ad esempio la risposta delle cellule ad un particolare fattore può essere identificata confrontando i lisati di cellule trattate con sostanze specifiche o cresciute in determinate condizioni con i lisati di cellule di controllo. Un'altra applicazione è nell'identificazione e nella profilazione dei tessuti malati.

I microarray di proteine ​​a fase inversa (RPPA) coinvolgono campioni complessi, come i lisati tissutali. Le cellule vengono isolate da vari tessuti di interesse e vengono lisate. Il lisato viene disposto sul microarray e sondato con anticorpi contro la proteina bersaglio di interesse. Questi anticorpi vengono tipicamente rilevati con saggi chemiluminescenti , fluorescenti o colorimetrici . I peptidi di riferimento sono stampati sui vetrini per consentire la quantificazione delle proteine ​​dei lisati del campione. Gli RPA consentono di determinare la presenza di proteine ​​alterate o altri agenti che possono essere il risultato di una malattia. In particolare, le modifiche post-traduzionali, che sono tipicamente alterate a causa della malattia, possono essere rilevate utilizzando gli RPA.

Microarray funzionali di proteine

I microarray funzionali di proteine ​​(noti anche come array di proteine ​​bersaglio) sono costruiti immobilizzando un gran numero di proteine ​​purificate e sono usati per identificare le interazioni proteina-proteina, proteina-DNA, proteina- RNA , proteina- fosfolipide e proteina-piccola molecola, per analizzare l'attività enzimatica e per rilevare gli anticorpi e dimostrare la loro specificità. Differiscono dagli array analitici in quanto gli array di proteine ​​funzionali sono composti da array contenenti proteine ​​​​funzionali a lunghezza intera o domini proteici. Questi chip proteici vengono utilizzati per studiare le attività biochimiche dell'intero proteoma in un singolo esperimento.

L'elemento chiave in qualsiasi analisi basata su microarray di proteine ​​funzionali è che le proteine ​​allineate devono mantenere la loro struttura nativa, in modo tale che sulla superficie dell'array possano avvenire interazioni funzionali significative. I vantaggi di controllare la modalità precisa di attacco alla superficie attraverso l'uso di un tag di affinità appropriato sono che le proteine ​​immobilizzate avranno un orientamento omogeneo, con conseguente maggiore attività specifica e maggiore rapporto segnale-rumore nei saggi, con meno interferenze da non- interazioni specifiche.

rilevamento

I metodi di rilevamento dell'array di proteine ​​devono fornire un segnale alto e uno sfondo basso. Il metodo più comune e ampiamente utilizzato per il rilevamento è l'etichettatura a fluorescenza, che è altamente sensibile, sicura e compatibile con gli scanner laser microarray prontamente disponibili. Possono essere utilizzate altre etichette, come etichette di affinità, fotochimiche o radioisotopi. Queste etichette sono attaccate alla sonda stessa e possono interferire con la reazione della proteina bersaglio della sonda. Pertanto, sono disponibili numerosi metodi di rilevamento senza etichetta, come risonanza plasmonica superficiale (SPR), nanotubi di carbonio, sensori a nanofili di carbonio (dove il rilevamento avviene tramite cambiamenti di conduttanza) e cantilever del sistema microelettromeccanico (MEMS). Tutti questi metodi di rilevamento senza etichetta sono relativamente nuovi e non sono ancora adatti per il rilevamento di interazioni proteiche ad alto rendimento; tuttavia, offrono molte promesse per il futuro. Saggi immunologici su impalcature micropillar "carta sintetica" tiolo-ene hanno dimostrato di generare un segnale di fluorescenza superiore.

La quantificazione delle proteine ​​su vetrini rivestiti di nitrocellulosa può utilizzare il rilevamento fluorescente vicino all'infrarosso. Ciò limita le interferenze dovute all'autofluorescenza della nitrocellulosa alle lunghezze d'onda UV utilizzate per le sonde di rilevamento fluorescenti standard.

Applicazioni

Ci sono cinque aree principali in cui vengono applicati gli array di proteine: diagnostica, proteomica, analisi funzionale delle proteine, caratterizzazione di anticorpi e sviluppo di trattamenti.

La diagnostica prevede la rilevazione di antigeni e anticorpi nei campioni di sangue; la profilazione dei sieri per scoprire nuovi biomarcatori di malattie ; il monitoraggio degli stati patologici e delle risposte alla terapia nella medicina personalizzata; il monitoraggio dell'ambiente e degli alimenti. Il saggio biologico digitale è un esempio di utilizzo di microarray proteici per scopi diagnostici. In questa tecnologia, una serie di micropozzetti su un chip di vetro/polimero viene seminata con perline magnetiche (rivestite con anticorpi marcati fluorescenti), sottoposta ad antigeni mirati e quindi caratterizzata da un microscopio attraverso il conteggio di pozzetti fluorescenti. Di recente è stata dimostrata una piattaforma di fabbricazione conveniente (utilizzando polimeri OSTE ) per tali array di micropozzetti ed è stato caratterizzato con successo il sistema modello di saggio biologico.

La proteomica riguarda il profilo di espressione proteica, cioè quali proteine ​​sono espresse nel lisato di una particolare cellula.

L'analisi funzionale delle proteine ​​è l'identificazione di interazioni proteina-proteina (es. identificazione di membri di un complesso proteico), interazioni proteina-fosfolipidi, piccoli bersagli molecolari, substrati enzimatici (in particolare i substrati delle chinasi ) e ligandi recettoriali.

La caratterizzazione dell'anticorpo sta caratterizzando la reattività crociata , la specificità e la mappatura degli epitopi .

Lo sviluppo del trattamento prevede lo sviluppo di terapie antigene-specifiche per l' autoimmunità , il cancro e le allergie; l'identificazione di piccoli bersagli molecolari potenzialmente utilizzabili come nuovi farmaci.

Sfide

Nonostante i notevoli investimenti fatti da diverse aziende, i chip proteici devono ancora inondare il mercato. I produttori hanno scoperto che le proteine ​​sono in realtà piuttosto difficili da gestire. La produzione di proteine ​​affidabili, coerenti e ad alto rendimento che sono correttamente piegate e funzionali è irta di difficoltà poiché spesso si traducono in una bassa resa di proteine ​​a causa della ridotta solubilità e della formazione di corpi di inclusione. Un chip proteico richiede molti più passaggi nella sua creazione rispetto a un chip DNA .

Ci sono un certo numero di approcci a questo problema che differiscono fondamentalmente a seconda che le proteine ​​siano immobilizzate attraverso interazioni non specifiche e poco definite, o attraverso un insieme specifico di interazioni note. Il primo approccio è attraente nella sua semplicità ed è compatibile con proteine ​​purificate derivate da fonti native o ricombinanti, ma presenta una serie di rischi. I più notevoli tra questi riguardano la natura incontrollata delle interazioni tra ciascuna proteina e la superficie; nella migliore delle ipotesi, ciò potrebbe dar luogo a una popolazione eterogenea di proteine ​​in cui i siti attivi sono talvolta occlusi dalla superficie; nel peggiore dei casi, potrebbe distruggere del tutto l'attività a causa dello sviluppo parziale o completo mediato dalla superficie della proteina immobilizzata.

Le sfide includono: 1) trovare una superficie e un metodo di attacco che permetta alle proteine ​​di mantenere la loro struttura secondaria o terziaria e quindi la loro attività biologica e le loro interazioni con altre molecole, 2) produrre una matrice con una lunga durata di conservazione in modo che le proteine sul chip non si denaturano in breve tempo, 3) identificare e isolare anticorpi o altre molecole di cattura contro ogni proteina del genoma umano, 4) quantificare i livelli di proteine ​​legate assicurando sensibilità ed evitando rumori di fondo, 5) estraendo il rilevato proteina dal chip per analizzarla ulteriormente, 6) ridurre il legame non specifico da parte degli agenti di cattura, 7) la capacità del chip deve essere sufficiente per consentire una rappresentazione il più completa possibile del proteoma; proteine ​​abbondanti sopraffanno la rilevazione di proteine ​​meno abbondanti come molecole di segnalazione e recettori, che sono generalmente di maggiore interesse terapeutico.

Guarda anche

• Imprinting di microarray e modellazione dell'energia superficiale
• Tecniche di rilevamento senza etichetta per microarray proteici

Riferimenti