Codice genetico espanso - Expanded genetic code

Non ci deve essere diafonia tra la nuova coppia tRNA/sintasi e le molecole esistenti di tRNA/sintasi, solo con i ribosomi

Un codice genetico espanso è un codice genetico modificato artificialmente in cui uno o più codoni specifici sono stati riassegnati per codificare un amminoacido che non è tra i 22 comuni amminoacidi proteinogenici codificati naturalmente .

I prerequisiti chiave per espandere il codice genetico sono:

• l' amminoacido non standard da codificare,
• un codone inutilizzato da adottare,
• un tRNA che riconosce questo codone, e
• una tRNA sintetasi che riconosce solo quel tRNA e solo l'amminoacido non standard.

L'espansione del codice genetico è un'area di ricerca della biologia sintetica , una disciplina biologica applicata il cui obiettivo è progettare sistemi viventi per scopi utili. L'espansione del codice genetico arricchisce il repertorio di strumenti utili a disposizione della scienza.

Nel maggio 2019, i ricercatori, in uno sforzo fondamentale, hanno segnalato la creazione di una nuova forma sintetica (possibilmente artificiale ) di vita vitale , una variante del batterio Escherichia coli , riducendo il numero naturale di 64 codoni nel genoma batterico a 61 codoni. (eliminando due dei sei codoni che codificano per la serina e uno dei tre codoni di stop) - di cui 59 utilizzati per codificare 20 amminoacidi .

introduzione

È interessante notare che il codice genetico per tutti gli organismi è fondamentalmente lo stesso, così che tutti gli esseri viventi usano lo stesso "linguaggio genetico". In generale, l'introduzione di nuovi amminoacidi innaturali funzionali nelle proteine ​​delle cellule viventi rompe l'universalità del linguaggio genetico, che idealmente porta a forme di vita alternative. Le proteine ​​sono prodotte grazie alle molecole del sistema di traduzione, che decodificano i messaggi dell'RNA in una stringa di amminoacidi. La traduzione dell'informazione genetica contenuta nell'RNA messaggero (mRNA) in una proteina è catalizzata dai ribosomi . Gli RNA di trasferimento (tRNA) sono usati come chiavi per decodificare l' mRNA nel suo polipeptide codificato . Il tRNA riconosce uno specifico codone a tre nucleotidi nell'mRNA con una sequenza complementare chiamata anticodone su una delle sue anse. Ogni codone di tre nucleotidi viene tradotto in uno dei venti amminoacidi naturali. Esiste almeno un tRNA per ogni codone e talvolta più codoni codificano per lo stesso amminoacido. Molti tRNA sono compatibili con diversi codoni. Un enzima chiamato amminoacil tRNA sintetasi lega in modo covalente l'amminoacido al tRNA appropriato. La maggior parte delle cellule ha una sintetasi diversa per ciascun amminoacido (20 o più sintetasi). D'altra parte, alcuni batteri hanno meno di 20 amminoacil tRNA sintetasi e introducono gli amminoacidi "mancanti" modificando un amminoacido strutturalmente correlato da parte di un enzima amminotransferasi . Una caratteristica sfruttata nell'espansione del codice genetico è il fatto che l'aminoacil tRNA sintetasi spesso non riconosce l'anticodone, ma un'altra parte del tRNA, il che significa che se l'anticodone dovesse essere mutato la codifica di quell'amminoacido cambierebbe in un nuovo codone. Nel ribosoma, l'informazione nell'mRNA viene tradotta in un amminoacido specifico quando il codone dell'mRNA corrisponde all'anticodone complementare di un tRNA e l'amminoacido attaccato viene aggiunto a una catena polipeptidica in crescita. Quando viene rilasciato dal ribosoma, la catena polipeptidica si ripiega in una proteina funzionante.

Per incorporare un nuovo amminoacido nel codice genetico sono necessarie diverse modifiche. In primo luogo, per la corretta traduzione di un nuovo amminoacido, il codone a cui è assegnato il nuovo amminoacido non può già codificare per uno dei 20 amminoacidi naturali. Di solito vengono utilizzati un codone senza senso ( codone di stop ) o un codone a quattro basi. In secondo luogo, è necessaria una nuova coppia di tRNA e aminoacil tRNA sintetasi, chiamata set ortogonale. Il set ortogonale non deve diafonia con i set endogeni di tRNA e sintetasi, pur essendo funzionalmente compatibile con il ribosoma e altri componenti dell'apparato di traduzione. Il sito attivo della sintetasi viene modificato per accettare solo il nuovo amminoacido. Molto spesso, una libreria di sintetasi mutanti viene esaminata per quella che carica il tRNA con l'amminoacido desiderato. La sintetasi è anche modificata per riconoscere solo il tRNA ortogonale. La coppia di tRNA sintetasi è spesso ingegnerizzata in altri batteri o cellule eucariotiche.

In questo ambito di ricerca, i 20 aminoacidi proteinogenici codificati sono indicati come aminoacidi standard, o in alternativa come aminoacidi naturali o canonici, mentre gli aminoacidi aggiunti sono denominati aminoacidi non standard (NSAA), o aminoacidi non naturali ( uAAs; termine non utilizzato nei documenti che trattano di amminoacidi naturali non proteinogenici, come la fosfoserina ), o amminoacidi non canonici.

Aminoacidi non standard

Tirosina e alcune varianti di tirosina sintetica utilizzate per l'etichettatura delle proteine. Diverse varianti della tirosina sono state sintetizzate e possono essere incorporate nelle proteine ​​utilizzando un codice genetico espanso. Le varianti qui raffigurate sono tutte utilizzate per il collegamento chimico o fotochimico. Ciò significa che l'AA incorporato reagisce specificamente con un particolare gruppo chimico (come idrazidi, ammine, azidi o tioli) o può essere attivato tramite UV per reticolare con altri AA.

Il primo elemento del sistema è l'aminoacido che viene aggiunto al codice genetico di un determinato ceppo dell'organismo.

Oltre 71 diversi NSAA sono stati aggiunti a diversi ceppi di E. coli , lievito o cellule di mammifero. A causa dei dettagli tecnici (sintesi chimica più facile degli NSAA, meno diafonia e più facile evoluzione dell'aminoacil-tRNA sintasi), gli NSAA sono generalmente più grandi degli amminoacidi standard e molto spesso hanno un nucleo di fenilalanina ma con una grande varietà di sostituenti differenti. Questi consentono un ampio repertorio di nuove funzioni, come l'etichettatura (vedi figura), come reporter fluorescente ( ad es. dansilalanina) o per produrre proteine ​​traduzionali in E. coli con modificazioni post-traduzionali eucariotiche ( ad es. fosfoserina, fosfotreonina e fosfotirosina).

Il lavoro fondamentale è stato riportato da Rolf Furtner, che da solo ha utilizzato la coppia tRNA ^Phe /PheRS di lievito per incorporare la p-iodofenilalanina in E.coli .

Gli amminoacidi non naturali incorporati nelle proteine ​​includono amminoacidi contenenti atomi pesanti per facilitare alcuni studi cristallografici a raggi X; amminoacidi con nuove proprietà steriche/impaccanti ed elettroniche; amminoacidi fotoreticolati che possono essere usati per sondare le interazioni proteina-proteina in vitro o in vivo; cheto, acetilene, azide e amminoacidi contenenti boronato che possono essere utilizzati per introdurre selettivamente un gran numero di sonde biofisiche, tag e nuovi gruppi funzionali chimici in proteine in vitro o in vivo ; amminoacidi redox attivi per sondare e modulare il trasferimento di elettroni; amminoacidi fotoingabbiati e fotoisomerizzabili per la fotoregolazione dei processi biologici; amminoacidi leganti metalli per catalisi e rilevamento di ioni metallici; amminoacidi che contengono catene laterali attive fluorescenti o infrarosse per sondare la struttura e la dinamica delle proteine; α-idrossiacidi e D- amminoacidi come sonde della conformazione del backbone e delle interazioni dei legami idrogeno; e amminoacidi solfatati e mimetici di amminoacidi fosforilati come sonde di modificazioni post-traduzionali.

La disponibilità dell'amminoacido non standard richiede che l'organismo lo importi dal terreno o lo biosintetizzi. Nel primo caso, l'amminoacido innaturale viene prima sintetizzato chimicamente nella sua forma L otticamente pura . Viene quindi aggiunto al mezzo di crescita della cellula. Una libreria di composti viene solitamente testata per l'uso nell'incorporazione del nuovo amminoacido, ma ciò non è sempre necessario, ad esempio, vari sistemi di trasporto possono gestire amminoacidi innaturali con catene laterali apolari. Nel secondo caso, è necessario ingegnerizzare una via biosintetica, ad esempio un ceppo di E. coli che biosintetizzi un nuovo amminoacido (p-aminofenilalanina) da fonti di carbonio di base e lo includa nel suo codice genetico. Un altro esempio: la produzione di fosfoserina, un metabolita naturale, e di conseguenza ha richiesto un'alterazione del suo flusso di percorso per aumentarne la produzione.

Assegnazione del codone

Un altro elemento del sistema è un codone da allocare al nuovo amminoacido.

Un grosso problema per l'espansione del codice genetico è che non ci sono codoni liberi. Il codice genetico ha un layout non casuale che mostra segni rivelatori di varie fasi dell'evoluzione primordiale, tuttavia, da allora si è congelato ed è conservato quasi universalmente. Tuttavia, alcuni codoni sono più rari di altri. Infatti, in E. coli (e in tutti gli organismi) l'uso del codone non è uguale, ma presenta diversi codoni rari (vedi tabella), il più raro è il codone di stop ambrato (UAG).

Soppressione del codone d'ambra

La possibilità di riassegnare i codoni è stata realizzata da Normanly et al. nel 1990, quando un ceppo mutante vitale di E. coli ha letto il codone di stop UAG ("ambra") . Ciò è stato possibile grazie alla rarità di questo codone e al fatto che il solo fattore di rilascio 1 fa terminare la traduzione del codone ambra. Successivamente, nel laboratorio di Schultz , la tRNATyr/tirosil-tRNA sintetasi (TyrRS) di Methanococcus jannaschii , un archeobatterio, è stata utilizzata per introdurre una tirosina invece di STOP, il valore predefinito del codone ambrato. Ciò è stato possibile a causa delle differenze tra le sintasi batteriche endogene e le sintasi archeali ortologhe, che non si riconoscono. Successivamente, il gruppo ha evoluto la coppia ortogonale tRNA/sintasi per utilizzare l'amminoacido non standard O- metiltirosina. Questa è stata seguita dalla naftilalanina più grande e dalla benzoilfenilalanina fotoreticolante, che ha dimostrato la potenziale utilità del sistema.

Il codone ambrato è il codone meno utilizzato in Escherichia coli , ma dirottarlo si traduce in una sostanziale perdita di idoneità. Uno studio, infatti, ha scoperto che c'erano almeno 83 peptidi maggiormente colpiti dal readthrough. Inoltre, l'etichettatura era incompleta. Di conseguenza, sono stati realizzati diversi ceppi per ridurre il costo di fitness, inclusa la rimozione di tutti i codoni ambrati dal genoma. Nella maggior parte dei ceppi di E. coli K-12 (vale a dire Escherichia coli (biologia molecolare) per i pedigree dei ceppi) ci sono 314 codoni di stop UAG. Di conseguenza, una mole di lavoro gigantesca è stata dedicata alla sostituzione di questi. Un approccio sperimentato dal gruppo del Prof. George Church di Harvard, è stato soprannominato MAGE in CAGE: questo si basava su una trasformazione multiplex e su una successiva ricombinazione di ceppi per rimuovere tutti i codoni UAG - l'ultima parte ha presentato un punto di arresto in un primo articolo, ma è stata superare. Ciò ha portato al ceppo di E. coli C321.ΔA, a cui mancano tutti i codoni UAG e RF1. Ciò ha permesso di fare un esperimento con questo ceppo per renderlo "dipendente" dall'aminoacido bifenilalanina sviluppando diversi enzimi chiave per richiederlo strutturalmente, quindi mettendo il suo codice genetico espanso sotto selezione positiva.

Riassegnazione del codone di senso raro

Oltre al codone ambra, sono stati considerati anche rari codoni di senso. Il codone AGG codifica per l'arginina, ma un ceppo è stato modificato con successo per farlo codificare per 6- N -allilossicarbonil-lisina. Un altro candidato è il codone AUA, che è insolito in quanto il suo rispettivo tRNA deve differenziarsi dall'AUG che codifica per la metionina (principalmente isoleucina, da cui la sua posizione). Per fare ciò, il tRNA dell'AUA ha una base speciale, la lisidina. La delezione della sintasi ( tilS ) è stata possibile grazie alla sostituzione del tRNA nativo con quello di Mycoplasma mobile (senza lisidina). L'idoneità ridotta è un primo passo per fare pressione sul ceppo affinché perda tutte le istanze di AUA, consentendone l'utilizzo per l'espansione del codice genetico.

Quattro codoni di base

Altri approcci includono l'aggiunta di un accoppiamento di basi extra o l'uso di ribosomi ortologhi che accettano, oltre al normale codice genetico tripletta, tRNA con codice quadruplo. Ciò ha permesso l'uso simultaneo di due amminoacidi innaturali, p -azidofenilalanina (pAzF) e N6-[(2-propinilossi)carbonil]lisina (CAK), che si reticolano tra loro mediante cicloaddizione di Huisgen . La decodifica quadruplicata nei ceppi wild-type non ricodificati è molto inefficiente. Ciò deriva dal fatto che l'interazione tra tRNA ingegnerizzati con complessi ternari o altri componenti di traduzione non è così favorevole e forte come con gli elementi di traduzione endogeni delle cellule. Questo problema può essere superato mediante l'ingegneria specifica e l'evoluzione del tRNA in grado di decodificare codoni quadrupli in ceppi non ricodificati. In questo modo possono essere generate fino a 4 diverse coppie quadruple ortogonali di tRNA/tRNA sintetasi.

coppia tRNA/sintetasi

Un altro elemento chiave è la coppia tRNA/sintetasi.

L'insieme ortologo di sintetasi e tRNA può essere mutato e vagliato attraverso l'evoluzione diretta per caricare il tRNA con un amminoacido diverso, anche nuovo. Le mutazioni al plasmide contenente la coppia possono essere introdotte mediante PCR incline all'errore o attraverso primer degenerati per il sito attivo della sintetasi. La selezione prevede più cicli di un processo in due fasi, in cui il plasmide viene trasferito in cellule che esprimono cloramfenicolo acetil transferasi con un codone ambrato prematuro. In presenza di cloramfenicolo tossico e dell'aminoacido non naturale, le cellule sopravvissute avranno scavalcato il codone ambrato utilizzando il tRNA amminoacilato ortogonale con gli amminoacidi standard o con quello non naturale. Per rimuovere il primo, il plasmide viene inserito in cellule con un gene barnasi (tossico) con un codone ambrato prematuro ma senza l'aminoacido non naturale, rimuovendo tutte le sintasi ortogonali che non riconoscono specificamente l'amminoacido non naturale. Oltre alla ricodifica del tRNA in un codone diverso, possono essere mutati per riconoscere un codone a quattro basi, consentendo ulteriori opzioni di codifica libere. L'amminoacido non naturale, di conseguenza, introduce diverse proprietà fisico-chimiche e biologiche per essere utilizzato come strumento per esplorare la struttura e la funzione delle proteine o per creare proteine ​​nuove o migliorate per scopi pratici.

Sono stati sviluppati diversi metodi per selezionare la sintetasi che accetta solo l'amminoacido non naturale. Uno dei quali è l'utilizzo di una combinazione di selezione positiva e negativa

Insiemi ortogonali in organismi modello

Le coppie ortogonali di sintetasi e tRNA che funzionano per un organismo potrebbero non funzionare per un altro, poiché la sintetasi può amminoacilare in modo errato i tRNA endogeni o il tRNA stesso può essere amminoacilato in modo errato da una sintetasi endogena. Di conseguenza, gli insiemi creati fino ad oggi differiscono tra gli organismi.

Nel 2017 è stato segnalato un topo progettato con un codice genetico esteso in grado di produrre proteine ​​con amminoacidi innaturali.

ribosomi ortogonali

Analogamente ai tRNA ortogonali e alle aminoacil tRNA sintetasi (aaRS), i ribosomi ortogonali sono stati progettati per funzionare in parallelo ai ribosomi naturali. I ribosomi ortogonali utilizzano idealmente trascrizioni di mRNA diverse rispetto alle loro controparti naturali e alla fine dovrebbero attingere anche a un pool separato di tRNA. Ciò dovrebbe alleviare parte della perdita di forma fisica che attualmente deriva ancora da tecniche come la soppressione del codone d'ambra. Inoltre, i ribosomi ortogonali possono essere mutati e ottimizzati per compiti particolari, come il riconoscimento di codoni quadrupli. Tale ottimizzazione non è possibile, o è altamente svantaggiosa per i ribosomi naturali.

o-Ribosoma

Nel 2005 sono stati pubblicati tre set di ribosomi, che non hanno riconosciuto l'mRNA naturale, ma hanno invece tradotto un pool separato di mRNA ortogonale (o-mRNA). Ciò è stato ottenuto modificando la sequenza di riconoscimento dell'mRNA, la sequenza Shine-Dalgarno , e la sequenza di riconoscimento corrispondente nell'rRNA 16S dei ribosomi, la cosiddetta sequenza Anti-Shine-Darlgarno. In questo modo l'accoppiamento delle basi, che di solito viene perso se una delle due sequenze viene mutata, rimane disponibile. Tuttavia, le mutazioni nell'rRNA 16S non erano limitate ai nucleotidi ovviamente appaiati delle basi della sequenza classica Anti-Shine-Darlgarno.

Ribo-X

Nel 2007 il gruppo di Jason W. Chin ha presentato un ribosoma ortogonale, ottimizzato per la soppressione del codone d'ambra. L'rRNA 16S è stato mutato in modo tale da legare il fattore di rilascio RF1 meno fortemente rispetto al ribosoma naturale. Questo ribosoma non ha eliminato il problema della riduzione dell'idoneità cellulare causata dalla soppressione dei codoni di stop nelle proteine ​​naturali. Tuttavia, attraverso la specificità migliorata, ha aumentato significativamente la resa della proteina bersaglio correttamente sintetizzata (da ~ 20% a > 60% per un codone ambrato da sopprimere e da <1% a > 20% per due codoni ambrati).

Ribo-Q

Nel 2010 il gruppo di Jason W. Chin ha presentato un'ulteriore versione ottimizzata del ribosoma ortogonale. Il Ribo-Q è un rRNA 16S ottimizzato per riconoscere i tRNA, che hanno anti-codoni quadrupli per riconoscere i codoni quadrupli, invece dei codoni tripletti naturali. Con questo approccio il numero di possibili codoni aumenta da 64 a 256. Anche tenendo conto di una varietà di codoni di stop, in questo modo potrebbero potenzialmente essere codificati più di 200 diversi amminoacidi.

Pinzatura ribosomiale

I ribosomi ortogonali descritti soprattutto si concentrano sull'ottimizzazione dell'rRNA 16S. Finora, questo rRNA 16S ottimizzato è stato combinato con subunità naturali di grandi dimensioni per formare ribosomi ortogonali. Se anche l'rRNA 23S, il componente principale dell'RNA della subunità ribosomiale grande, doveva essere ottimizzato, doveva essere assicurato che non vi fosse diafonia nell'assemblaggio dei ribosomi ortogonali e naturali (vedi figura X B). Per garantire che l'rRNA 23S ottimizzato si formi solo in ribosomi con l'rRNA 16S ottimizzato, i due rRNA sono stati combinati in un'unica trascrizione. Inserendo la sequenza per l'rRNA 23S in una regione ad anello della sequenza dell'rRNA 16S, entrambe le subunità adottano ancora pieghe funzionanti. Poiché i due rRNA sono collegati e quindi in costante vicinanza, si legano preferibilmente l'uno con l'altro, non con altre subunità ribosomiali fluttuanti libere.

Centro di peptidil transferasi ingegnerizzato

Nel 2014 è stato dimostrato che alterando il centro della peptidil transferasi dell'rRNA 23S, si potrebbero creare ribosomi che attingono a pool ortogonali di tRNA. L'estremità 3' dei tRNA è universalmente conservata come CCA. Le due citidine si accoppiano con due guanine, l'rRNA 23S, per legare il tRNA al ribosoma. Questa interazione è necessaria per la fedeltà traslazionale. Tuttavia, co-mutando i nucleotidi leganti in modo tale che possano ancora appaiarsi, la fedeltà traslazionale può essere conservata. L'estremità 3' del tRNA è mutata da CCA a CGA, mentre due nucleotidi citidinici nei siti ribosomi A e P sono mutati in guanidina. Questo porta a ribosomi che non accettano tRNA naturali come substrati e a tRNA, che non possono essere usati come substrato dai ribosomi naturali.
Per utilizzare efficacemente tali tRNA, dovrebbero essere aminoacilati da specifici aaRS ortogonali. La maggior parte degli aaRS naturali riconosce l'estremità 3' del tRNA corrispondente. aaRS per questi tRNA 3'-mutati non sono ancora disponibili. Finora, questo sistema ha dimostrato di funzionare solo in un ambiente di traduzione in vitro in cui l'aminoacilazione del tRNA ortogonale è stata ottenuta utilizzando i cosiddetti "flexizymes".I flexizimi sono ribozimi con attività di tRNA-ammino-aclilazione.

Applicazioni

Con un codice genetico espanso, l'amminoacido innaturale può essere geneticamente diretto a qualsiasi sito scelto nella proteina di interesse. L'elevata efficienza e fedeltà di questo processo consente un migliore controllo del posizionamento della modifica rispetto alla modifica della proteina post-traduzionale, che, in generale, prenderà di mira tutti gli amminoacidi dello stesso tipo, come il gruppo tiolico della cisteina e il gruppo amminico della lisina. Inoltre, un codice genetico ampliato consente di effettuare modifiche in vivo . La capacità di indirizzare in modo specifico le frazioni chimiche sintetizzate in laboratorio nelle proteine ​​consente molti tipi di studi che altrimenti sarebbero estremamente difficili, come ad esempio:

• Sondaggio della struttura e della funzione delle proteine: utilizzando amminoacidi con dimensioni leggermente diverse come l' O -metiltirosina o la dansilalanina invece della tirosina e inserendo porzioni reporter codificate geneticamente (che cambiano colore e/o spin-attive) in siti proteici selezionati, informazioni chimiche sulla struttura e la funzione della proteina può essere misurata.
• Indagare il ruolo delle modifiche post-traduzionali nella struttura e nella funzione delle proteine: utilizzando amminoacidi che imitano le modifiche post-traduzionali come la fosfoserina, è possibile ottenere proteine ​​biologicamente attive e la natura sito-specifica dell'incorporazione degli amminoacidi può portare a informazioni su come la posizione, la densità e la distribuzione della fosforilazione proteica influenzano la funzione proteica.
• Identificazione e regolazione dell'attività delle proteine: utilizzando amminoacidi fotoingabbiati, la funzione delle proteine ​​può essere "attivata" o disattivata illuminando l'organismo.
• Modificare il meccanismo d'azione di una proteina: si può partire dal gene per una proteina che lega una certa sequenza di DNA e, inserendo un amminoacido chimicamente attivo nel sito di legame, convertirlo in una proteina che taglia il DNA anziché legandolo.
• Miglioramento dell'immunogenicità e superamento dell'autotolleranza: sostituendo le tirosine scelte strategicamente con la p- nitrofenilalanina, è possibile rendere immunogena una auto-proteina tollerata .
• Distruzione selettiva di componenti cellulari selezionati: utilizzando un codice genetico espanso, porzioni chimiche innaturali e distruttive (a volte chiamate "testate chimiche") possono essere incorporate in proteine ​​che prendono di mira specifici componenti cellulari.
• Produzione di proteine ​​migliori: l'evoluzione dei batteriofagi T7 su un ceppo di E. coli non in evoluzione che ha codificato la 3-iodotirosina sul codone ambrato, ha determinato una popolazione più in forma rispetto al wild-type grazie alla presenza di iodotirosina nel suo proteoma
• Sondaggio della localizzazione delle proteine ​​e dell'interazione proteina-proteina nei batteri.

Futuro

L'espansione del codice genetico è ancora agli inizi. La metodologia attuale utilizza solo un amminoacido non standard alla volta, mentre idealmente potrebbero essere utilizzati più amminoacidi. In effetti, il gruppo di Jason Chin ha recentemente battuto il record per un ceppo di E.coli geneticamente codificato che può incorporare contemporaneamente fino a 4 amminoacidi innaturali. Inoltre, è stato sviluppato un software che consente la combinazione di ribosomi ortogonali e coppie innaturali di tRNA/RS al fine di migliorare la resa e la fedeltà delle proteine.

Genoma sintetico ricodificato

Un modo per ottenere la codifica di più amminoacidi innaturali è sintetizzare un genoma riscritto. Nel 2010, al costo di 40 milioni di dollari , è stato costruito un organismo, Mycoplasma laboratorium , controllato da un genoma sintetico, ma non ricodificato. Il primo organismo geneticamente ricodificato è stato creato da una collaborazione tra i laboratori di George Church e Farren Isaacs, quando l'E.coli MG1655 di tipo selvatico è stato ricodificato in modo tale che tutti i 321 codoni di stop (UAG) conosciuti siano stati sostituiti con codoni sinonimi di UAA e rilascio il fattore 1 è stato eliminato per eliminare l'interazione con il codone di stop esogeno e migliorare la sintesi proteica innaturale. Nel 2019 è stato creato Escherichia coli Syn61, con un genoma ricodificato a 4 megabase composto da soli 61 codoni invece dei 64 naturali. Oltre all'eliminazione dell'utilizzo di codoni rari, è necessario aumentare la specificità del sistema quante più tRNA riconoscere diversi codoni

Alfabeto genetico espanso

Un altro approccio è espandere il numero di basi azotate per aumentare la capacità di codifica.

Una coppia di basi innaturali (UBP) è una subunità progettata (o nucleobase ) del DNA che viene creata in laboratorio e non si trova in natura. Una dimostrazione di UBP è stata ottenuta in vitro dal gruppo di Ichiro Hirao presso l' istituto RIKEN in Giappone. Nel 2002, hanno sviluppato una coppia di basi innaturale tra 2-ammino-8-(2-tienil)purina (s) e piridina-2-one (y) che funziona in vitro nella trascrizione e traduzione per l'incorporazione sito-specifica di non -aminoacidi standard in proteine. Nel 2006, hanno creato 7-(2-tienil)imidazo[4,5-b]piridina (Ds) e pirrolo-2-carbaldeide (Pa) come terza coppia di basi per la replicazione e la trascrizione. Successivamente, Ds e 4-[3-(6-amminoesanamido)-1-propinil]-2-nitropirrolo (Px) sono stati scoperti come una coppia ad alta fedeltà nell'amplificazione PCR. Nel 2013, hanno applicato la coppia Ds-Px alla generazione di aptameri del DNA mediante selezione in vitro (SELEX) e hanno dimostrato che l'espansione dell'alfabeto genetico aumenta significativamente le affinità degli aptameri del DNA alle proteine ​​bersaglio.

Nel 2012, un gruppo di scienziati americani guidati da Floyd Romesberg, un biologo chimico presso lo Scripps Research Institute di San Diego, in California, ha pubblicato che il suo team ha progettato una coppia di basi innaturali (UBP). I due nuovi nucleotidi artificiali o Unnatural Base Pair (UBP) sono stati denominati " d5SICS " e " dNaM ". Più tecnicamente, questi nucleotidi artificiali che portano basi azotate idrofobe , presentano due anelli aromatici fusi che formano un complesso (d5SICS-dNaM) o una coppia di basi nel DNA. Nel 2014 lo stesso team dello Scripps Research Institute ha riferito di aver sintetizzato un tratto di DNA circolare noto come plasmide contenente coppie di basi naturali TA e CG insieme al laboratorio di Romesberg con le migliori prestazioni progettato e inserito nelle cellule del comune batterio E. coli che ha replicato con successo le coppie di basi innaturali attraverso più generazioni. Questo è il primo esempio conosciuto di un organismo vivente che trasmette un codice genetico espanso alle generazioni successive. Ciò è stato in parte ottenuto mediante l'aggiunta di un gene algale di supporto che esprime un trasportatore di nucleotidi trifosfato che importa in modo efficiente i trifosfati sia di d5SICSTP che di dNaMTP nei batteri di E. coli . Quindi, i percorsi naturali di replicazione batterica li utilizzano per replicare accuratamente il plasmide contenente d5SICS-dNaM.

Il successo dell'incorporazione di una terza coppia di basi in un microrganismo vivente è un significativo passo avanti verso l'obiettivo di espandere notevolmente il numero di amminoacidi che possono essere codificati dal DNA, ampliando così il potenziale per gli organismi viventi di produrre nuove proteine . Le stringhe artificiali di DNA non codificano ancora per nulla, ma gli scienziati ipotizzano che potrebbero essere progettate per produrre nuove proteine ​​che potrebbero avere usi industriali o farmaceutici.

Nel maggio 2014, i ricercatori hanno annunciato di aver introdotto con successo due nuovi nucleotidi artificiali nel DNA batterico e, includendo singoli nucleotidi artificiali nei terreni di coltura, sono stati in grado di far passare i batteri 24 volte; non hanno creato mRNA o proteine ​​in grado di utilizzare i nucleotidi artificiali.

Metodi correlati

Metodo di incorporazione selettiva della pressione (SPI) per la produzione di alloproteine

Ci sono stati molti studi che hanno prodotto proteine ​​con aminoacidi non standard, ma non alterano il codice genetico. Queste proteine, dette alloproteine , vengono prodotte incubando le cellule con un amminoacido non naturale in assenza di un amminoacido codificato simile in modo che il primo venga incorporato nella proteina al posto del secondo, ad esempio l' acido L -2-amminoesanoico ( Ahx) per la metionina (Met).

Questi studi si basano sul naturale attività promiscua della aminoacil tRNA sintetasi aggiungere al suo obiettivo tRNA un amminoacido non naturale (ad esempio analogico) simile al substrato naturale, per isoleucina scambiando di esempio metionil-tRNA sintetasi per metionina. Nella cristallografia proteica, ad esempio, l'aggiunta di selenometionina al terreno di una coltura di un ceppo metionina-auxotrofico provoca proteine ​​contenenti selenometionina rispetto alla metionina ( cioè dispersione anomala a lunghezze d'onda multiple per ragione). Un altro esempio è l' aggiunta di fotoleucina e fotometionina invece di leucina e metionina alla proteina cross-label. Allo stesso modo, alcuni funghi tolleranti al tellurio possono incorporare la tellurocisteina e la tellurometionina nella loro proteina invece di cisteina e metionina. L'obiettivo dell'espansione del codice genetico è più radicale in quanto non sostituisce un amminoacido, ma ne aggiunge uno o più al codice. D'altra parte, le sostituzioni dell'intero proteoma sono eseguite in modo più efficiente dalle sostituzioni globali di amminoacidi. Ad esempio, in E. coli e B. subtilis sono state tentate sostituzioni a livello di proteoma globale di amminoacidi naturali con analoghi fluorurati . Una sostituzione completa del triptofano con tienopirrolo-alanina in risposta a 20899 codoni UGG in E. coli è stata segnalata nel 2015 da Budisa e Söll . Inoltre, molti fenomeni biologici, come il ripiegamento e la stabilità delle proteine, si basano su effetti sinergici in molte posizioni nella sequenza proteica.

In questo contesto, il metodo SPI genera varianti proteiche ricombinanti o alloproteine ​​direttamente mediante sostituzione di amminoacidi naturali con controparti non naturali. Un ospite di espressione auxotrofi dell'amminoacido è integrato con un analogo dell'amminoacido durante l'espressione della proteina bersaglio. Questo approccio evita le insidie ​​dei metodi basati sulla soppressione ed è superiore in termini di efficienza, riproducibilità e configurazione sperimentale estremamente semplice. Numerosi studi hanno dimostrato come la sostituzione globale degli amminoacidi canonici con vari analoghi isosterici abbia causato perturbazioni strutturali minime ma cambiamenti drammatici nelle proprietà spettrali termodinamiche, di ripiegamento, di aggregazione e nell'attività enzimatica.

sintesi in vitro

L'espansione del codice genetico sopra descritta è in vivo . Un'alternativa è la modifica della codifica degli esperimenti di traduzione in vitro . Ciò richiede l'esaurimento di tutti i tRNA e la reintroduzione selettiva di alcuni tRNA aminoacilati, alcuni chimicamente aminoacilati.

Sintesi chimica

Esistono diverse tecniche per produrre chimicamente i peptidi , generalmente mediante la chimica di protezione in fase solida. Ciò significa che qualsiasi amminoacido (protetto) può essere aggiunto alla sequenza nascente.

Nel novembre 2017, un team dello Scripps Research Institute ha riferito di aver costruito un genoma semisintetico di batteri E. coli utilizzando sei diversi acidi nucleici (contro i quattro presenti in natura). Le due "lettere" extra formano una terza coppia di basi innaturale. Gli organismi risultanti sono stati in grado di prosperare e sintetizzare proteine ​​usando "aminoacidi non naturali". La coppia di basi innaturale utilizzata è dNaM –dTPT3. Questa coppia di basi innaturale è stata dimostrata in precedenza, ma questo è il primo rapporto di trascrizione e traduzione di proteine ​​utilizzando una coppia di basi innaturale.

Guarda anche

• Bioingegneria
• Evoluzione diretta
• DNA di Hachimoji
• Elenco dei codici genetici
• Analogo dell'acido nucleico
• Aminoacidi non proteinogenici
• Etichettatura delle proteine
• Metodi proteici
• Biologia sintetica
• xenobiologia

Riferimenti