Erweiterter genetischer Code - Expanded genetic code

Es darf kein Crosstalk zwischen dem neuen tRNA/Synthase-Paar und den bestehenden tRNA/Synthase-Molekülen geben, nur mit den Ribosomen

Ein erweiterter genetischer Code ist ein künstlich modifizierter genetischer Code, bei dem ein oder mehrere spezifische Codons neu zugewiesen wurden, um eine Aminosäure zu codieren , die nicht zu den 22 üblichen natürlich codierten proteinogenen Aminosäuren gehört .

Die wichtigsten Voraussetzungen für die Erweiterung des genetischen Codes sind:

• die zu codierende Nicht-Standard-Aminosäure ,
• ein ungenutztes Codon zum Annehmen,
• eine tRNA, die dieses Codon erkennt, und
• eine tRNA-Synthetase, die nur diese tRNA und nur die nicht standardmäßige Aminosäure erkennt.

Die Erweiterung des genetischen Codes ist ein Forschungsgebiet der synthetischen Biologie , einer angewandten biologischen Disziplin, deren Ziel es ist, lebende Systeme für nützliche Zwecke zu entwickeln. Die Erweiterung des genetischen Codes bereichert das Repertoire nützlicher Werkzeuge, die der Wissenschaft zur Verfügung stehen.

Im Mai 2019 Forscher in einem Meilenstein Anstrengung, berichteten die Schaffung eines neuen synthetischen (möglicherweise künstlich ) Form tragfähige Leben , eine Variante der Bakterien Escherichia coli , durch die natürliche Zahl von 64 zu reduzieren Codons in dem bakteriellen Genom zu 61 Codons (Beseitigung von zwei der sechs Codons, die für Serin kodieren, und eines von drei Stop-Codons) – von denen 59 verwendet wurden, um 20 Aminosäuren zu kodieren .

Einführung

Bemerkenswert ist, dass der genetische Code für alle Organismen grundsätzlich gleich ist, so dass alle Lebewesen dieselbe „genetische Sprache“ verwenden. Im Allgemeinen bricht die Einführung neuer funktioneller nichtnatürlicher Aminosäuren in Proteine ​​lebender Zellen die Universalität der genetischen Sprache, die idealerweise zu alternativen Lebensformen führt. Proteine ​​werden dank der Moleküle des Translationssystems hergestellt, die die RNA-Nachrichten in eine Reihe von Aminosäuren entschlüsseln. Die Übersetzung der genetischen Information, die in der Boten-RNA (mRNA) enthalten ist, in ein Protein wird durch Ribosomen katalysiert . Transfer-RNAs (tRNA) werden als Schlüssel verwendet, um die mRNA in ihr kodiertes Polypeptid zu entschlüsseln . Die tRNA erkennt ein spezifisches Drei-Nukleotid-Codon in der mRNA mit einer komplementären Sequenz namens Anticodon an einer ihrer Schleifen. Jedes Codon aus drei Nukleotiden wird in eine von zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren übersetzt. Es gibt mindestens eine tRNA für jedes Codon und manchmal codieren mehrere Codons für dieselbe Aminosäure. Viele tRNAs sind mit mehreren Codons kompatibel. Ein Enzym namens Aminoacyl-tRNA-Synthetase bindet die Aminosäure kovalent an die entsprechende tRNA. Die meisten Zellen haben für jede Aminosäure (20 oder mehr Synthetasen) eine andere Synthetase. Andererseits haben einige Bakterien weniger als 20 Aminoacyl-tRNA-Synthetasen und führen die "fehlende" Aminosäure(n) durch Modifikation einer strukturell verwandten Aminosäure durch ein Aminotransferase- Enzym ein. Eine bei der Erweiterung des genetischen Codes ausgenutzte Eigenschaft ist die Tatsache, dass die Aminoacyl-tRNA-Synthetase oft nicht das Anticodon, sondern einen anderen Teil der tRNA erkennt, was bedeutet, dass bei einer Mutation des Anticodons die Codierung dieser Aminosäure zu ein neues Kodon. Im Ribosom wird die Information der mRNA in eine bestimmte Aminosäure übersetzt, wenn das mRNA-Codon mit dem komplementären Anticodon einer tRNA übereinstimmt, und die angehängte Aminosäure wird an eine wachsende Polypeptidkette angehängt. Wenn es vom Ribosom freigesetzt wird, faltet sich die Polypeptidkette zu einem funktionierenden Protein.

Um eine neue Aminosäure in den genetischen Code einzubauen, sind mehrere Änderungen erforderlich. Erstens kann für eine erfolgreiche Translation einer neuen Aminosäure das Codon, dem die neue Aminosäure zugeordnet ist, nicht bereits für eine der 20 natürlichen Aminosäuren kodieren. Üblicherweise werden ein Nonsense-Codon ( Stopcodon ) oder ein Vier-Basen-Codon verwendet. Zweitens wird ein neues Paar von tRNA und Aminoacyl-tRNA-Synthetase benötigt, diese werden als orthogonaler Satz bezeichnet. Das orthogonale Set darf nicht mit den endogenen tRNA- und Synthetase-Sets überkreuzen, während es dennoch mit dem Ribosom und anderen Komponenten des Translationsapparats funktionell kompatibel ist. Das aktive Zentrum der Synthetase ist so modifiziert, dass es nur die neue Aminosäure akzeptiert. Am häufigsten wird eine Bibliothek mutierter Synthetasen auf eine gescreent, die die tRNA mit der gewünschten Aminosäure auflädt. Die Synthetase ist auch so modifiziert, dass sie nur die orthogonale tRNA erkennt. Das tRNA-Synthetase-Paar wird oft in anderen Bakterien oder eukaryontischen Zellen hergestellt.

In diesem Forschungsbereich werden die 20 kodierten proteinogenen Aminosäuren als Standardaminosäuren oder alternativ als natürliche oder kanonische Aminosäuren bezeichnet, während die hinzugefügten Aminosäuren als Nichtstandardaminosäuren (NSAAs) oder nichtnatürliche Aminosäuren bezeichnet werden ( uAAs; Begriff, der in Veröffentlichungen nicht verwendet wird, die sich mit natürlichen nicht-proteinogenen Aminosäuren wie Phosphoserin oder nicht-kanonischen Aminosäuren befassen.

Nicht-Standard-Aminosäuren

Tyrosin und einige synthetische Tyrosinvarianten, die zur Proteinmarkierung verwendet werden. Verschiedene Varianten von Tyrosin wurden synthetisiert und können unter Verwendung eines erweiterten genetischen Codes in Proteine ​​eingebaut werden. Die hier abgebildeten Varianten werden alle zur chemischen oder photochemischen Verknüpfung verwendet. Dies bedeutet, dass die eingebauten AA spezifisch entweder mit einer bestimmten chemischen Gruppe (wie Hydraziden, Aminen, Aziden oder Thiolen) reagiert oder UV-aktiviert werden kann, um mit anderen AAs zu vernetzen.

Das erste Element des Systems ist die Aminosäure, die dem genetischen Code eines bestimmten Organismusstamms hinzugefügt wird.

Über 71 verschiedene NSAAs wurden verschiedenen Stämmen von E. coli , Hefe oder Säugerzellen zugesetzt . Aufgrund technischer Details (einfachere chemische Synthese von NSAAs, weniger Crosstalk und leichtere Evolution der Aminoacyl-tRNA-Synthase) sind die NSAAs im Allgemeinen größer als Standardaminosäuren und haben meistens einen Phenylalanin-Kern, aber mit einer großen Vielfalt an unterschiedlichen Substituenten. Diese ermöglichen ein großes Repertoire an neuen Funktionen, wie Markierung (siehe Abbildung), als fluoreszierender Reporter ( zB Dansylalanin) oder die Herstellung von translationalen Proteinen in E. coli mit eukaryotischen posttranslationalen Modifikationen ( zB Phosphoserin, Phosphothreonin und Phosphotyrosin).

Die Gründungsarbeit wurde von Rolf Furtner berichtet, der im Alleingang ein Hefe-tRNA- ^Phe /PheRS-Paar verwendete, um p-Iodphenylalanin in E.coli einzubauen .

In Proteine ​​eingebaute unnatürliche Aminosäuren umfassen schweratomhaltige Aminosäuren, um bestimmte röntgenkristallographische Untersuchungen zu erleichtern; Aminosäuren mit neuartigen sterischen/Packungs- und elektronischen Eigenschaften; photovernetzende Aminosäuren, die verwendet werden können, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in vitro oder in vivo zu untersuchen; Keto-, Acetylen-, Azid- und Boronat-enthaltende Aminosäuren, die verwendet werden können, um selektiv eine große Anzahl biophysikalischer Sonden, Tags und neuer chemischer funktioneller Gruppen in Proteine in vitro oder in vivo einzuführen ; redoxaktive Aminosäuren zur Sondierung und Modulation des Elektronentransfers; photoaktivierbare und photoisomerisierbare Aminosäuren zur Photoregulation biologischer Prozesse; metallbindende Aminosäuren für die Katalyse und Metallionenerfassung; Aminosäuren, die fluoreszierende oder infrarotaktive Seitenketten enthalten, um Proteinstruktur und -dynamik zu untersuchen; α-Hydroxysäuren und D- Aminosäuren als Sonden der Rückgratkonformation und Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen; und sulfatierte Aminosäuren und Mimetika von phosphorylierten Aminosäuren als Sonden für posttranslationale Modifikationen.

Die Verfügbarkeit der nicht standardmäßigen Aminosäure erfordert, dass der Organismus sie entweder aus dem Medium importiert oder biosynthetisiert. Im ersten Fall wird die nichtnatürliche Aminosäure zunächst chemisch in ihrer optisch reinen L- Form synthetisiert . Es wird dann dem Wachstumsmedium der Zelle zugesetzt. Gewöhnlich wird eine Bibliothek von Verbindungen auf die Verwendung beim Einbau der neuen Aminosäure getestet, dies ist jedoch nicht immer notwendig, zum Beispiel können verschiedene Transportsysteme mit unnatürlichen Aminosäuren mit apolaren Seitenketten umgehen. Im zweiten Fall muss ein Biosyntheseweg entwickelt werden, zum Beispiel ein E. coli- Stamm, der eine neue Aminosäure (p-Aminophenylalanin) aus basischen Kohlenstoffquellen biosynthetisiert und in seinen genetischen Code einschließt. Ein weiteres Beispiel: Die Produktion von Phosphoserin, einem natürlichen Metaboliten, erforderte folglich eine Änderung seines Stoffwechselflusses, um seine Produktion zu steigern.

Codon-Zuordnung

Ein weiteres Element des Systems ist ein Codon, das der neuen Aminosäure zugeordnet wird.

Ein Hauptproblem bei der Erweiterung des genetischen Codes besteht darin, dass es keine freien Codons gibt. Der genetische Code hat ein nicht zufälliges Layout, das verräterische Anzeichen für verschiedene Phasen der ursprünglichen Evolution zeigt, jedoch ist er seitdem eingefroren und nahezu universell konserviert. Dennoch sind einige Codons seltener als andere. Tatsächlich ist die Codonverwendung in E. coli (und allen Organismen) nicht gleich, weist jedoch mehrere seltene Codons auf (siehe Tabelle), wobei das seltenste das Amber-Stop-Codon (UAG) ist.

Amber-Codon-Suppression

Die Möglichkeit der Neuzuweisung von Codons wurde von Normanly et al. im Jahr 1990, als ein lebensfähiger mutierter Stamm von E. coli das UAG ("amber") Stopcodon durchliest . Dies war möglich dank der Seltenheit dieses Codons und der Tatsache, dass allein der Freisetzungsfaktor 1 dazu führt, dass das Amber-Codon die Translation beendet. Später wurde im Schultz- Labor die tRNATyr/Tyrosyl-tRNA-Synthetase (TyrRS) aus Methanococcus jannaschii , einem Archaebakterium, verwendet, um ein Tyrosin anstelle von STOP, dem Standardwert des Amber-Codons, einzuführen. Dies war aufgrund der Unterschiede zwischen den endogenen bakteriellen Synthasen und der orthologen Archaeen-Synthasen möglich, die sich gegenseitig nicht erkennen. Anschließend entwickelte die Gruppe das orthologonale tRNA/Synthase-Paar, um die nicht standardmäßige Aminosäure O- Methyltyrosin zu nutzen. Es folgten das größere Naphthylalanin und das photovernetzende Benzoylphenylalanin, die den potentiellen Nutzen des Systems bewiesen.

Das Amber-Codon ist das am wenigsten verwendete Codon in Escherichia coli , aber seine Entführung führt zu einem erheblichen Fitnessverlust. Eine Studie ergab tatsächlich, dass mindestens 83 Peptide stark vom Readthrough betroffen waren. Außerdem war die Markierung unvollständig. Infolgedessen wurden mehrere Stämme hergestellt, um die Fitnesskosten zu reduzieren, einschließlich der Entfernung aller Bernsteincodons aus dem Genom. In den meisten E. coli K-12-Stämmen (nämlich Escherichia coli (Molekularbiologie) für Stammbäume) gibt es 314 UAG-Stopcodons. Folglich wurde ein enormer Arbeitsaufwand in deren Ersatz gesteckt. Ein Ansatz, der von der Gruppe von Prof. George Church aus Harvard entwickelt wurde, wurde MAGE in CAGE genannt: Dieser beruhte auf einer Multiplex-Transformation und anschließender Stammrekombination, um alle UAG-Codons zu entfernen – letzterer Teil stellte in einer ersten Veröffentlichung einen Haltepunkt dar, war aber überwinden. Dies führte zu dem E. coli- Stamm C321.ΔA, dem alle UAG-Codons und RF1 fehlen. Dies ermöglichte ein Experiment mit diesem Stamm, um ihn von der Aminosäure Biphenylalanin "süchtig" zu machen, indem mehrere Schlüsselenzyme entwickelt wurden, die ihn strukturell benötigen, wodurch sein erweiterter genetischer Code einer positiven Selektion unterzogen wurde.

Seltene Sense-Codon-Neuzuweisung

Neben dem Amber-Codon wurden auch seltene Sense-Codons zur Verwendung in Betracht gezogen. Das AGG-Codon kodiert für Arginin, aber ein Stamm wurde erfolgreich modifiziert, damit er für 6- N- Allyloxycarbonyl-Lysin kodiert. Ein weiterer Kandidat ist das AUA-Codon, das insofern ungewöhnlich ist, als sich seine jeweilige tRNA von AUG unterscheiden muss, das für Methionin (primär Isoleucin, daher seine Position) kodiert. Dazu besitzt die AUA-tRNA eine spezielle Base, Lysidin. Die Deletion der Synthase ( tilS ) war durch den Ersatz der nativen tRNA durch die von Mycoplasma mobile (kein Lysidin) möglich. Die reduzierte Fitness ist ein erster Schritt, um die Sorte unter Druck zu setzen, alle Instanzen von AUA zu verlieren, sodass sie für die Erweiterung des genetischen Codes verwendet werden kann.

Vier Basencodons

Andere Ansätze umfassen das Hinzufügen zusätzlicher Basenpaarungen oder die Verwendung von orthologen Ribosomen, die zusätzlich zum regulären genetischen Triplett-Code tRNAs mit Quadrupel-Code akzeptieren. Dies ermöglichte die gleichzeitige Verwendung von zwei nichtnatürlichen Aminosäuren, p- Azidophenylalanin (pAzF) und N6-[(2-Propinyloxy)carbonyl]lysin (CAK), die durch Huisgen-Cycloaddition miteinander vernetzen . Die Vervierfachung der Dekodierung in nicht-rekodierten Wildtyp-Stämmen ist sehr ineffizient. Dies liegt daran, dass die Wechselwirkung zwischen konstruierten tRNAs mit ternären Komplexen oder anderen Translationskomponenten nicht so günstig und stark ist wie mit zelleigenen Translationselementen. Dieses Problem kann durch gezielte Entwicklung und Entwicklung von tRNA, die Quadruplet-Codons in nicht-rekodierten Stämmen dekodieren kann, überwunden werden. Bis zu 4 verschiedene orthogonale Quadruplett-tRNA/tRNA-Synthetase-Paare können auf diese Weise erzeugt werden.

tRNA/Synthetase-Paar

Ein weiteres Schlüsselelement ist das tRNA/Synthetase-Paar.

Der orthologe Satz von Synthetase und tRNA kann durch gerichtete Evolution mutiert und gescreent werden, um die tRNA mit einer anderen, sogar neuen Aminosäure aufzuladen. Mutationen des Plasmids, das das Paar enthält, können durch fehleranfällige PCR oder durch degenerierte Primer für das aktive Zentrum der Synthetase eingeführt werden. Die Selektion umfasst mehrere Runden eines zweistufigen Verfahrens, bei dem das Plasmid in Zellen transferiert wird, die Chloramphenicol-Acetyltransferase mit einem vorzeitigen Amber-Codon exprimieren. In Gegenwart von toxischem Chloramphenicol und der nicht-natürlichen Aminosäure haben die überlebenden Zellen das Amber-Codon unter Verwendung der orthogonalen tRNA überschrieben, die entweder mit den Standard-Aminosäuren oder der nicht-natürlichen aminoacyliert ist. Um ersteres zu entfernen, wird das Plasmid in Zellen mit einem Barnase-Gen (toxisch) mit einem vorzeitigen Amber-Codon, jedoch ohne die nicht-natürliche Aminosäure, inseriert, wodurch alle orthogonalen Synthasen entfernt werden, die die nicht-natürliche Aminosäure nicht spezifisch erkennen. Neben der Umcodierung der tRNA in ein anderes Codon können sie mutiert werden, um ein Vier-Basen-Codon zu erkennen, was zusätzliche freie Codierungsoptionen ermöglicht. Als Ergebnis führt die nicht-natürliche Aminosäure verschiedene physikalisch-chemische und biologische Eigenschaften ein, um als Werkzeug zur Erforschung der Proteinstruktur und -funktion oder zur Herstellung neuartiger oder verbesserter Proteine ​​für praktische Zwecke verwendet zu werden.

Es wurden mehrere Verfahren zur Auswahl der Synthetase entwickelt, die nur die nicht-natürliche Aminosäure akzeptiert. Eine davon ist die Verwendung einer Kombination aus positiver und negativer Selektion

Orthogonale Sets in Modellorganismen

Die orthogonalen Paare von Synthetase und tRNA, die für einen Organismus funktionieren, funktionieren möglicherweise nicht für einen anderen, da die Synthetase endogene tRNAs falsch aminoacyliert oder die tRNA selbst durch eine endogene Synthetase falsch aminoacyliert wird. Infolgedessen unterscheiden sich die bisher erstellten Sets zwischen den Organismen.

Im Jahr 2017 wurde über eine Maus berichtet, die mit einem erweiterten genetischen Code konstruiert wurde, der Proteine ​​mit nichtnatürlichen Aminosäuren produzieren kann.

Orthogonale Ribosomen

Ähnlich wie orthogonale tRNAs und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen (aaRSs) wurden orthogonale Ribosomen so konstruiert, dass sie parallel zu den natürlichen Ribosomen arbeiten. Orthogonale Ribosomen verwenden idealerweise andere mRNA-Transkripte als ihre natürlichen Gegenstücke und sollten letztendlich auch auf einen separaten Pool von tRNA zurückgreifen. Dies sollte einen Teil des Fitnessverlusts mildern, der derzeit noch durch Techniken wie die Amber-Codon-Suppression entsteht. Darüber hinaus können orthogonale Ribosomen mutiert und für bestimmte Aufgaben, wie die Erkennung von Quadruplett-Codons, optimiert werden. Eine solche Optimierung ist für natürliche Ribosomen nicht möglich oder sehr nachteilig.

o-Ribosom

Im Jahr 2005 wurden drei Sätze von Ribosomen veröffentlicht, die natürliche mRNA nicht erkannten, sondern stattdessen einen separaten Pool orthogonaler mRNA (o-mRNA) translatierten. Dies wurde durch Änderung der Erkennungssequenz der mRNA, der Shine-Dalgarno-Sequenz , und der entsprechenden Erkennungssequenz in der 16S-rRNA von Ribosomen, der sogenannten Anti-Shine-Darlgarno-Sequenz, erreicht. Auf diese Weise bleibt die Basenpaarung, die normalerweise verloren geht, wenn eine der beiden Sequenzen mutiert ist, verfügbar. Die Mutationen in der 16S rRNA waren jedoch nicht auf die offensichtlich basenpaarenden Nukleotide der klassischen Anti-Shine-Darlgarno-Sequenz beschränkt.

Ribo-X

2007 präsentierte die Gruppe von Jason W. Chin ein orthogonales Ribosom, das für die Amber-Codon-Suppression optimiert wurde. Die 16S rRNA wurde so mutiert, dass sie den Freisetzungsfaktor RF1 weniger stark band als das natürliche Ribosom. Dieses Ribosom beseitigte nicht das Problem einer verringerten Zellfitness, die durch unterdrückte Stoppcodons in natürlichen Proteinen verursacht wird. Durch die verbesserte Spezifität erhöhte es jedoch die Ausbeuten an korrekt synthetisiertem Zielprotein signifikant (von ~20% auf >60% für ein zu supprimierendes Amber-Codon und <1% bis >20% für zwei Amber-Codons).

Ribo-Q

2010 präsentierte die Gruppe von Jason W. Chin eine weiter optimierte Version des orthogonalen Ribosoms. Ribo-Q ist eine 16S rRNA, die für die Erkennung von tRNAs optimiert ist, die Quadruplet-Anticodons haben, um Quadruplett-Codons anstelle der natürlichen Triplett-Codons zu erkennen. Mit diesem Ansatz steigt die Zahl der möglichen Codons von 64 auf 256. Sogar unter Berücksichtigung einer Vielzahl von Stop-Codons könnten auf diese Weise potenziell mehr als 200 verschiedene Aminosäuren codiert werden.

Ribosomenheftung

Die oben beschriebenen orthogonalen Ribosomen konzentrieren sich alle auf die Optimierung der 16S-rRNA. Bisher wurde diese optimierte 16S-rRNA mit natürlichen großen Untereinheiten kombiniert, um orthogonale Ribosomen zu bilden. Um auch die 23S rRNA, die Haupt-RNA-Komponente der großen ribosomalen Untereinheit, zu optimieren, musste sichergestellt werden, dass es beim Zusammenbau von orthogonalen und natürlichen Ribosomen zu keinem Crosstalk kommt (siehe Abbildung X B). Um sicherzustellen, dass sich optimierte 23S-rRNA nur mit der optimierten 16S-rRNA zu Ribosomen formen würde, wurden die beiden rRNAs zu einem Transkript kombiniert. Durch Einfügen der Sequenz für die 23S rRNA in eine Loop-Region der 16S rRNA Sequenz nehmen beide Untereinheiten noch funktionierende Faltungen an. Da die beiden rRNAs verknüpft und somit in ständiger Nähe sind, binden sie vorzugsweise aneinander und nicht an andere frei schwebende ribosomale Untereinheiten.

Generiertes Peptidyltransferase-Zentrum

2014 wurde gezeigt, dass durch Veränderung des Peptidyltransferasezentrums der 23S rRNA Ribosomen erzeugt werden können, die auf orthogonalen Pools von tRNA zurückgreifen. Das 3'-Ende von tRNAs ist allgemein als CCA konserviert. Die beiden Cytidine bilden Basenpaare mit zwei Guaninen der 23S-rRNA, um die tRNA an das Ribosom zu binden. Diese Interaktion ist für die Übersetzungstreue erforderlich. Durch Co-Mutieren der bindenden Nukleotide jedoch so, dass sie immer noch Basenpaare bilden können, kann die Translationstreue konserviert werden. Das 3'-Ende der tRNA ist von CCA zu CGA mutiert, während zwei Cytidinnukleotide in den Ribosomen A- und P-Stellen zu Guanidin mutiert sind. Dies führt zu Ribosomen, die natürlich vorkommende tRNAs nicht als Substrate akzeptieren und zu tRNAs, die von natürlichen Ribosomen nicht als Substrat verwendet werden können.
Um solche tRNAs effektiv nutzen zu können, müssten sie durch spezifische, orthogonale aaRSs aminoacyliert werden. Die meisten natürlich vorkommenden aaRSs erkennen das 3'-Ende ihrer entsprechenden tRNA. aaRSs für diese 3'-mutierten tRNAs sind noch nicht verfügbar. Bisher wurde gezeigt, dass dieses System nur in einer in-vitro-Translationsumgebung funktioniert, in der die Aminoacylierung der orthogonalen tRNA mithilfe sogenannter „Flexizyme“ erreicht wurde.Flexizyme sind Ribozyme mit tRNA-Amino-Acylierungsaktivität.

Anwendungen

Mit einem erweiterten genetischen Code kann die unnatürliche Aminosäure genetisch an eine beliebige gewählte Stelle im interessierenden Protein gerichtet werden. Die hohe Effizienz und Genauigkeit dieses Prozesses ermöglicht eine bessere Kontrolle der Platzierung der Modifikation im Vergleich zur posttranslationalen Modifikation des Proteins, die im Allgemeinen auf alle Aminosäuren desselben Typs abzielt, wie die Thiolgruppe von Cystein und die Aminogruppe von Lysin. Außerdem ermöglicht ein erweiterter genetischer Code die Durchführung von Modifikationen in vivo . Die Fähigkeit, im Labor synthetisierte chemische Einheiten ortsspezifisch in Proteine ​​zu lenken, ermöglicht viele Arten von Studien, die ansonsten extrem schwierig wären, wie zum Beispiel:

• Untersuchung von Proteinstruktur und -funktion: Durch die Verwendung von Aminosäuren mit leicht unterschiedlicher Größe wie O- Methyltyrosin oder Dansylalanin anstelle von Tyrosin und durch das Einfügen genetisch kodierter Reportereinheiten (farbwechselnd und/oder spinaktiv) in ausgewählte Proteinstellen, chemische Informationen über die Struktur und Funktion des Proteins gemessen werden.
• Untersuchung der Rolle posttranslationaler Modifikationen in Proteinstruktur und -funktion: Durch die Verwendung von Aminosäuren, die posttranslationale Modifikationen wie Phosphoserin nachahmen , können biologisch aktive Proteine ​​erhalten werden, und die ortsspezifische Natur des Aminosäureeinbaus kann zu Informationen führen wie die Position, Dichte und Verteilung der Proteinphosphorylierung die Proteinfunktion beeinflusst.
• Proteinaktivität erkennen und regulieren: Durch den Einsatz von photoaktivierbaren Aminosäuren kann die Proteinfunktion durch Beleuchten des Organismus „ein- oder ausgeschaltet“ werden.
• Die Wirkungsweise eines Proteins ändern: Man kann mit dem Gen für ein Protein beginnen, das eine bestimmte DNA-Sequenz bindet, und es durch Einfügen einer chemisch aktiven Aminosäure in die Bindungsstelle in ein Protein umwandeln, das die DNA schneidet und nicht bindet es.
• Verbesserung der Immunogenität und Überwindung der Selbsttoleranz: Durch Ersetzen strategisch ausgewählter Tyrosine durch p- Nitrophenylalanin kann ein verträgliches Selbstprotein immunogen gemacht werden.
• Selektive Zerstörung ausgewählter Zellkomponenten: Unter Verwendung eines erweiterten genetischen Codes können unnatürliche, zerstörerische chemische Einheiten (manchmal als "chemische Sprengköpfe" bezeichnet) in Proteine ​​eingebaut werden, die auf bestimmte Zellkomponenten abzielen.
• Besseres Protein produzieren: Die Evolution von T7-Bakteriophagen auf einem sich nicht entwickelnden E. coli- Stamm, der 3-Jodtyrosin auf dem Amber-Codon kodierte, führte dank des Vorhandenseins von Jodtyrosin in seinem Proteom zu einer Population, die fitter war als die Wildtyp-Population
• Sondierung der Proteinlokalisierung und Protein-Protein-Interaktion in Bakterien.

Zukunft

Die Erweiterung des genetischen Codes steckt noch in den Kinderschuhen. Die derzeitige Methodik verwendet jeweils nur eine Nicht-Standard-Aminosäure, wohingegen idealerweise mehrere verwendet werden könnten. Tatsächlich hat die Gruppe von Jason Chin kürzlich den Rekord für einen genetisch umkodierten E.coli- Stamm gebrochen, der bis zu 4 unnatürliche Aminosäuren gleichzeitig aufnehmen kann. Darüber hinaus wurde eine Software entwickelt, die die Kombination von orthogonalen Ribosomen und unnatürlichen tRNA/RS-Paaren ermöglicht, um die Proteinausbeute und -treue zu verbessern.

Umkodiertes synthetisches Genom

Eine Möglichkeit, die Kodierung mehrerer nichtnatürlicher Aminosäuren zu erreichen, besteht darin, ein neu geschriebenes Genom zu synthetisieren. Im Jahr 2010 wurde für 40 Millionen US-Dollar ein Organismus, Mycoplasma laboratorium , konstruiert, der von einem synthetischen, aber nicht neu kodierten Genom kontrolliert wurde. Der erste genetisch umkodierte Organismus wurde durch eine Zusammenarbeit zwischen den Labors von George Church und Farren Isaacs geschaffen, als der Wildtyp E.coli MG1655 so umkodiert wurde, dass alle 321 bekannten Stop-Codons (UAG) durch synonyme UAA-Codons ersetzt und freigesetzt wurden Faktor 1 wurde ausgeschaltet, um die Interaktion mit dem exogenen Stopcodon zu eliminieren und die unnatürliche Proteinsynthese zu verbessern. Im Jahr 2019 wurde Escherichia coli Syn61 geschaffen, mit einem 4 Megabasen umkodierten Genom, das aus nur 61 Codons anstelle der natürlichen 64 besteht. Neben der Eliminierung der Verwendung seltener Codons muss die Spezifität des Systems um so viele tRNA mehrere Codons erkennen

Erweitertes genetisches Alphabet

Ein anderer Ansatz besteht darin, die Zahl der Nukleobasen zu erhöhen, um die Kodierungskapazität zu erhöhen.

Ein unnatürliches Basenpaar (UBP) ist eine entworfene Untereinheit (oder Nukleobase ) der DNA, die in einem Labor hergestellt wird und in der Natur nicht vorkommt. Eine Demonstration von UBPs wurde in vitro von Ichiro Hiraos Gruppe am RIKEN- Institut in Japan durchgeführt. 2002 entwickelten sie ein unnatürliches Basenpaar zwischen 2-Amino-8-(2-thienyl)purin (s) und Pyridin-2-on (y), das in vitro bei der Transkription und Translation für den ortsspezifischen Einbau von nicht- -Standardaminosäuren in Proteine. 2006 schufen sie 7-(2-Thienyl)imidazo[4,5-b]pyridin (Ds) und Pyrrol-2-carbaldehyd (Pa) als drittes Basenpaar für die Replikation und Transkription. Danach wurde Ds und 4-[3-(6-Aminohexanamido)-1-propinyl]-2-nitropyrrol (Px) als High-Fidelity-Paar bei der PCR-Amplifikation entdeckt. Im Jahr 2013 wandten sie das Ds-Px-Paar auf die DNA-Aptamer-Erzeugung durch in-vitro- Selektion (SELEX) an und zeigten, dass die genetische Alphabet-Expansion die DNA-Aptamer-Affinitäten zu Zielproteinen signifikant erhöht.

Im Jahr 2012 veröffentlichte eine Gruppe amerikanischer Wissenschaftler unter der Leitung von Floyd Romesberg, einem chemischen Biologen am Scripps Research Institute in San Diego, Kalifornien, dass sein Team ein unnatürliches Basenpaar (UBP) entwarf. Die beiden neuen künstlichen Nukleotide oder Unnatürlichen Basenpaare (UBP) wurden " d5SICS " und " dNaM " genannt . Technisch gesehen weisen diese künstlichen Nukleotide, die hydrophobe Nukleobasen tragen , zwei kondensierte aromatische Ringe auf , die einen (d5SICS-dNaM)-Komplex oder ein Basenpaar in der DNA bilden. Im Jahr 2014 berichtete das gleiche Team vom Scripps Research Institute, dass sie einen Abschnitt zirkulärer DNA, bekannt als ein Plasmid mit natürlichen TA- und CG-Basenpaaren, zusammen mit dem leistungsstärksten Labor von UBP Romesberg synthetisiert und in Zellen des Alltäglichen eingefügt haben Bakterium E. coli , das die unnatürlichen Basenpaare über mehrere Generationen hinweg erfolgreich replizierte. Dies ist das erste bekannte Beispiel für einen lebenden Organismus, der einen erweiterten genetischen Code an nachfolgende Generationen weitergibt. Dies wurde teilweise durch die Zugabe eines unterstützenden Algengens erreicht, das einen Nukleotidtriphosphat- Transporter exprimiert, der die Triphosphate von sowohl d5SICSTP als auch dNaMTP effizient in E. coli- Bakterien importiert . Dann verwenden die natürlichen bakteriellen Replikationswege sie, um das Plasmid, das d5SICS-dNaM enthält , genau zu replizieren .

Der erfolgreiche Einbau eines dritten Basenpaares in einen lebenden Mikroorganismus ist ein bedeutender Durchbruch in Richtung auf das Ziel, die Zahl der Aminosäuren, die von der DNA kodiert werden können, stark zu erhöhen , wodurch das Potenzial für lebende Organismen zur Produktion neuer Proteine ​​erweitert wird . Die künstlichen DNA-Stränge kodieren noch für nichts, aber Wissenschaftler spekulieren, dass sie entwickelt werden könnten, um neue Proteine ​​herzustellen, die industrielle oder pharmazeutische Anwendungen haben könnten.

Im Mai 2014 gaben die Forscher bekannt, dass sie erfolgreich zwei neue künstliche Nukleotide in die bakterielle DNA eingeführt hatten und durch die Aufnahme einzelner künstlicher Nukleotide in das Kulturmedium die Bakterien 24 Mal passieren konnten; sie erzeugten keine mRNA oder Proteine, die die künstlichen Nukleotide verwenden könnten.

Verwandte Methoden

Selective Pressure Incorporation (SPI)-Verfahren zur Herstellung von Alloproteinen

Es gab viele Studien, die Proteine ​​mit nicht standardmäßigen Aminosäuren produziert haben, aber sie verändern den genetischen Code nicht. Dieses Protein, Alloprotein genannt , wird hergestellt, indem Zellen mit einer nichtnatürlichen Aminosäure in Abwesenheit einer ähnlich kodierten Aminosäure inkubiert werden, damit die erstere anstelle der letzteren in das Protein eingebaut wird, zum Beispiel L -2-Aminohexansäure ( Ahx) für Methionin (Met).

Diese Studien beruhen auf der natürlichen promiskuitiven Aktivität der Aminoacyl-tRNA-Synthetase , um ihrer Ziel-tRNA eine unnatürliche Aminosäure (dh ein Analogon) ähnlich dem natürlichen Substrat hinzuzufügen, beispielsweise das Isoleucin der Methionyl-tRNA-Synthase, das Isoleucin mit Methionin verwechselt. In der Proteinkristallographie zum Beispiel führt die Zugabe von Selenomethionin zu den Medien einer Kultur eines Methionin-auxotrophen Stammes zu Proteinen, die Selenomethionin im Gegensatz zu Methionin enthalten ( nämlich eine anomale Multiwellenlängendispersion aus Gründen). Ein weiteres Beispiel ist, dass Photoleucin und Photomethionin anstelle von Leucin und Methionin hinzugefügt werden, um das Protein zu kreuzen. In ähnlicher Weise können einige Tellur-tolerante Pilze Tellurocystein und Telluromethionin anstelle von Cystein und Methionin in ihr Protein einbauen . Das Ziel der Erweiterung des genetischen Codes ist radikaler, da es keine Aminosäure ersetzt, sondern dem Code eine oder mehrere hinzufügt. Andererseits werden proteomweite Substitutionen am effizientesten durch globale Aminosäuresubstitutionen durchgeführt. Beispielsweise wurden in E. coli und B. subtilis globale proteomweite Substitutionen natürlicher Aminosäuren durch fluorierte Analoga versucht . Eine vollständige Tryptophan-Substitution durch Thienopyrrol-Alanin als Reaktion auf 20899 UGG-Codons in E. coli wurde 2015 von Budisa und Söll berichtet . Darüber hinaus beruhen viele biologische Phänomene wie Proteinfaltung und -stabilität auf synergistischen Effekten an vielen Stellen der Proteinsequenz.

In diesem Zusammenhang erzeugt das SPI-Verfahren rekombinante Proteinvarianten oder Alloproteine ​​direkt durch Substitution natürlicher Aminosäuren durch nichtnatürliche Gegenstücke. Ein Aminosäure-auxotropher Expressionswirt wird während der Zielproteinexpression mit einem Aminosäureanalog ergänzt. Dieser Ansatz vermeidet die Fallstricke suppressionsbasierter Methoden und ist diesen hinsichtlich Effizienz, Reproduzierbarkeit und einem extrem einfachen Versuchsaufbau überlegen. Zahlreiche Studien zeigten, wie die globale Substitution von kanonischen Aminosäuren durch verschiedene isosterische Analoga minimale strukturelle Störungen, aber dramatische Veränderungen der thermodynamischen, Faltungs-, Aggregationsspektraleigenschaften und der enzymatischen Aktivität verursacht.

In-vitro- Synthese

Die oben beschriebene Erweiterung des genetischen Codes erfolgt in vivo . Eine Alternative ist die Änderung der Kodierung von in vitro- Translationsexperimenten. Dies erfordert die Abreicherung aller tRNAs und die selektive Wiedereinführung bestimmter aminoacylierter tRNAs, von denen einige chemisch aminoacyliert sind.

Chemische Synthese

Es gibt mehrere Techniken zur chemischen Herstellung von Peptiden , im Allgemeinen durch Festphasen-Schutzchemie. Dies bedeutet, dass jede (geschützte) Aminosäure in die entstehende Sequenz hinzugefügt werden kann.

Im November 2017 berichtete ein Team des Scripps Research Institute , ein halbsynthetisches Genom von E. coli- Bakterien unter Verwendung von sechs verschiedenen Nukleinsäuren (gegenüber vier in der Natur vorkommenden) konstruiert zu haben . Die beiden zusätzlichen „Buchstaben“ bilden ein drittes, unnatürliches Basenpaar. Die resultierenden Organismen konnten gedeihen und Proteine ​​​​mit "unnatürlichen Aminosäuren" synthetisieren. Das verwendete unnatürliche Basenpaar ist dNaM –dTPT3. Dieses unnatürliche Basenpaar wurde bereits zuvor gezeigt, aber dies ist der erste Bericht über die Transkription und Translation von Proteinen unter Verwendung eines unnatürlichen Basenpaars.

Siehe auch

• Biotechnik
• Gezielte Evolution
• Hachimoji-DNA
• Liste der genetischen Codes
• Nukleinsäureanalogon
• Nicht proteinogene Aminosäuren
• Proteinmarkierung
• Proteinmethoden
• Synthetische Biologie
• Xenobiologie

Verweise