c-Raf - c-Raf
RAF proto-oncogène sérine/thréonine-protéine kinase, également connue sous le nom de proto-oncogène c-RAF ou simplement c-Raf ou encore Raf-1, est une enzyme qui chez l'homme est codée par le gène RAF1 . La protéine c-Raf fait partie de la voie ERK1/2 en tant que MAP kinase (MAP3K) qui fonctionne en aval de la sous - famille Ras des GTPases associées à la membrane. C-Raf est un membre de la famille Raf kinase de protéines kinases spécifiques à la sérine/thréonine , du groupe de kinases TKL (Tyrosine-kinase-like).
Découverte
Le premier gène Raf, v-Raf a été trouvé en 1983. Il a été isolé du rétrovirus murin portant le numéro 3611. Il a rapidement été démontré qu'il était capable de transformer des fibroblastes de rongeurs en lignées cellulaires cancéreuses , ce gène a donc reçu le nom de Virus- Fibrosarcome Rapidement Accéléré (V-RAF). Un an plus tard, un autre gène transformant a été trouvé dans le rétrovirus aviaire MH2, nommé v-Mil - qui s'est avéré être très similaire au v-Raf. Les chercheurs ont pu démontrer que ces gènes codent pour des enzymes ayant une activité sérine-thréonine kinase. Des homologues cellulaires normaux de v-Raf et v-Mil ont rapidement été trouvés dans le génome de la souris et du poulet (d'où le nom c-Raf pour le gène cellulaire normal Raf), et il est devenu clair que ceux-ci aussi avaient un rôle dans la régulation de la croissance et la division cellulaire. Nous savons maintenant que c-Raf est un composant principal de la première voie décrite de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) : la signalisation ERK1/2 . Il agit comme une kinase MAP3, initiant toute la cascade de kinases. Des expériences ultérieures ont montré que les gènes Raf cellulaires normaux peuvent également muter pour devenir des oncogènes, en "suralimentant" l'activité MEK1/2 et ERK1/2. En fait, les génomes des vertébrés contiennent plusieurs gènes Raf. Plusieurs années plus tard, après la découverte de c-Raf, deux autres kinases apparentées ont été décrites : A-Raf et B-Raf . Ce dernier est devenu l'objet de la recherche ces dernières années, car une grande partie des tumeurs humaines sont porteuses de mutations « pilotes » oncogènes dans le gène B-Raf. Ces mutations induisent une activité élevée et incontrôlée des enzymes Raf. Ainsi, l'intérêt diagnostique et thérapeutique des kinases Raf a atteint un nouveau pic ces dernières années.
Structure
Le gène humain c-Raf est situé sur le chromosome 3 . Au moins deux isoformes d' ARNm ont été décrites (provenant de l'inclusion ou de la suppression d'un exon alternatif ) qui ne présentent que des différences minimes. L'isoforme principale plus courte - constituée de 17 exons - code pour une protéine kinase de 648 acides aminés.
De la même manière que de nombreuses autres MAPKKK , c-Raf est une protéine multidomaine , avec plusieurs domaines supplémentaires pour faciliter la régulation de son activité catalytique . Sur son segment N-terminal, un domaine de liaison Ras (RBD) et un domaine homologue de la C-kinase 1 (domaine C1) se trouvent l'un à côté de l'autre. Les structures des deux domaines conservés ont été résolues au cours des dernières décennies, mettant en lumière les mécanismes de leur régulation.
Le domaine de liaison Ras présente un repli semblable à celui de l'ubiquitine (comme beaucoup d'autres petits domaines associant les protéines G) et se lie sélectivement aux protéines Ras liées au GTP uniquement. (Vous pouvez voir cette interaction en détail dans la boîte PDB jointe à l'article. Elle montre Rap1 en complexe avec le RBD de c-Raf.)
Le domaine C1 - immédiatement en aval du domaine de liaison Ras - est un doigt de zinc spécial , riche en cystéines et stabilisé par deux ions zinc. Il est similaire aux domaines Cl de liaison au diacylglycérol des enzymes de la protéine kinase C (PKC). Mais contrairement à la PKC, les domaines Cl des kinases de la famille Raf ne se lient pas au diacylglycérol. Au lieu de cela, ils interagissent avec d'autres lipides, tels que le céramide ou l'acide phosphatidique, et aident même à reconnaître le Ras activé (GTP-Ras).
La proximité de ces deux domaines ainsi que plusieurs lignes de données expérimentales suggèrent qu'ils agissent comme une seule unité pour réguler négativement l'activité du domaine de la protéine kinase, par interaction physique directe. Historiquement, ce bloc auto-inhibiteur a été étiqueté comme la région CR1 (« Région conservée 1 »), la région charnière étant nommée CR2, et le domaine kinase CR3. Malheureusement, la structure précise de la kinase auto-inhibée reste inconnue.
Entre le bloc de domaine auto-inhibiteur et le domaine de kinase catalytique, un segment long - caractéristique de toutes les protéines Raf - peut être trouvé. Il est fortement enrichi en acides aminés sérine , mais sa séquence précise est mal conservée à travers les gènes Raf apparentés. Cette région semble être intrinsèquement non structurée et très flexible. Son rôle le plus probable est d'agir comme une "charnière" naturelle entre les domaines auto-inhibiteur et catalytique rigidement repliés, permettant des mouvements complexes et des réarrangements conformationnels profonds au sein de la molécule. Cette région charnière contient un petit îlot conservé d'acides aminés, qui sont responsables de la reconnaissance des protéines 14-3-3 , mais uniquement lorsqu'une sérine critique (Ser259 dans le c-Raf humain) est phosphorylée. Un deuxième motif similaire se trouve sur l'extrémité C-terminale (centrée autour du Ser 621) phosphorylable de toutes les enzymes Raf, mais en aval du domaine kinase.
La moitié C-terminale de c-Raf se replie en un seul domaine protéique, responsable de l'activité catalytique. La structure de ce domaine kinase est bien connue à la fois par c-Raf et B-Raf. Elle est très similaire à d'autres kinases Raf et protéines KSR, et nettement similaire à certaines autres kinases MAP3, telles que la famille Mixed Lineage Kinase (MLK). Ensemble, ils forment le groupe de protéines kinases Tyrosine Kinase Like (TKL). Bien que certaines caractéristiques unissent leurs domaines catalytiques aux protéines tyrosine kinases, l'activité des TKL est limitée à la phosphorylation des résidus sérine et thréonine dans les protéines cibles. Le substrat le plus important des kinases Raf (en dehors d'elle-même) sont les kinases MKK1 et MKK2 , dont l'activité dépend strictement des événements de phosphorylation effectués par les Rafs.
Relations évolutives
Le c-Raf humain fait partie d'une famille plus large de protéines kinases apparentées. Deux autres membres - trouvés chez la plupart des vertébrés - appartiennent à la même famille : B-Raf et A-Raf . Outre la longueur différente de leurs extrémités N- et C-terminales non conservées, ils partagent tous la même architecture de domaine, la même structure et la même régulation. Par rapport aux c-Raf et B-Raf relativement bien connus, la fonction précise de A-Raf est très peu connue, mais on pense également qu'elle est similaire aux deux autres membres de la famille. On pense que tous ces gènes sont le produit de duplications complètes de gènes ou de génomes à l'aube de l'évolution des vertébrés, à partir d'un seul gène Raf ancestral. La plupart des autres organismes animaux ne possèdent qu'un seul gène Raf. Il est appelé Phl ou Draf chez la drosophile et Lin-45 chez C. elegans.
Les animaux multicellulaires possèdent également un type de kinase étroitement apparenté à Raf : il s'agit du suppresseur de kinase de Ras (KSR). Les vertébrés comme les mammifères ont deux gènes KSR paralogues au lieu d'un : KSR1 et KSR2 . Leur domaine kinase C-terminal est très similaire à Raf (appelé à l'origine CA5 dans KSR et CR3 dans Raf), mais la région régulatrice N-terminale diffère. Bien qu'ils aient également la charnière flexible (CA4 dans KSR) et un domaine C1 (CA3 dans KSR) avant celui-ci, les KSR manquent entièrement du domaine de liaison Ras. Au lieu de cela, ils ont des régions régulatrices uniques sur leurs extrémités N, appelées à l'origine CA1 ("zone conservée 1") et CA2. Pendant longtemps, la structure du domaine CA1 était un mystère. Cependant, en 2012, la structure de la région CA1 dans KSR1 a été résolue : il s'agissait d'un domaine SAM divergent (motif alpha stérile), complété par des coiled-coils (CC-SAM) : ceci est censé aider les KSR en membrane obligatoire. Les KSR, comme les Rafs, ont également les motifs d'association jumeaux 14-3-3 (qui dépendent de la phosphorylation), mais possèdent également de nouveaux motifs de liaison MAPK sur leurs régions charnières. Avec une séquence typique Phe-x-Phe-Pro (FxFP), ces motifs sont importants pour la régulation par rétroaction des kinases Raf dans la voie ERK1/2 . Selon nos connaissances actuelles, les KSR participent également à la même voie que Raf, bien qu'ils ne jouent qu'un rôle auxiliaire. Avec une très faible activité kinase intrinsèque, ils ont longtemps été considérés comme inactifs, jusqu'à ce que leur activité catalytique soit enfin démontrée ces dernières années. Mais même alors, ils ne contribuent que de manière négligeable à la phosphorylation de MKK1 et MKK2 . Le rôle principal de la KSR semble être de fournir un partenaire d'hétérodimérisation aux enzymes Raf, facilitant grandement leur activation par allostérie. Des phénomènes similaires ont été décrits pour d'autres kinases MAP3. ASK2, par exemple, est une mauvaise enzyme en soi, et son activité semble être liée à l'hétérodimérisation ASK1/ASK2.
Les kinases de type Raf sont totalement absentes des champignons. Mais le séquençage récent d'autres opisthokontes (par exemple Capsspora owczarzaki ) a révélé la présence de véritables kinases Raf chez les eucaryotes unicellulaires. Par conséquent, il est possible que les protéines Raf soient un héritage ancien et que les ancêtres des champignons aient secondairement perdu la signalisation Raf-dépendante. Les voies fongiques de la MAP kinase qui sont homologues à la voie ERK1/2 des mammifères (Fus3 et Kss1 chez la levure) sont activées par des kinases liées à MEKK (par exemple Ste11 chez la levure) au lieu des enzymes Raf.
Les kinases Raf trouvées dans les rétrovirus (tels que le v-Raf murin) sont dérivées secondairement des gènes vertébrés correspondants de leurs hôtes. Ces gènes Raf codent pour des protéines fortement tronquées, auxquelles il manque le domaine auto-inhibiteur N-terminal entier et les motifs de liaison 14-3-3. De telles troncatures sévères sont connues pour induire une activité incontrôlée des Raf kinases : c'est exactement ce dont un virus peut avoir besoin pour une reproduction efficace.
Régulation de l'activité
Comme mentionné ci-dessus, la régulation de l'activité de c-Raf est complexe. En tant que "gardien" de la voie ERK1/2 , il est contrôlé par une multitude de mécanismes inhibiteurs et ne peut normalement pas être activé en une seule étape. Le mécanisme de régulation le plus important implique l'association physique directe du bloc auto-inhibiteur N-terminal au domaine kinase de c-Raf. Il en résulte l'occlusion du site catalytique et l'arrêt complet de l'activité kinase. Cet état "fermé" ne peut être soulagé que si le domaine auto-inhibiteur de Raf engage un partenaire en compétition avec son propre domaine kinase, le plus important Ras lié au GTP. Les petites protéines G activées peuvent ainsi rompre les interactions intramoléculaires : il en résulte un changement de conformation (« ouverture ») de c-Raf nécessaire à l'activation de la kinase et à la liaison au substrat.
Les protéines 14-3-3 contribuent également à l'autoinhibition. Comme les protéines 14-3-3 sont toutes connues pour former des dimères constitutifs, leurs assemblages ont deux sites de liaison. Ainsi, le dimère agit comme une « menotte moléculaire », bloquant leurs partenaires de liaison à une distance et une orientation fixes. Lorsque les motifs de liaison 14-3-3 jumeaux précisément positionnés sont engagés par un seul dimère de protéine 14-3-3 (tel que 14-3-3 zeta), ils deviennent verrouillés dans une conformation qui favorise l'autoinhibition et ne permet pas le désengagement des domaines auto-inhibiteur et catalytique. Ce "verrouillage" de c-Raf (et d'autres Rafs ainsi que KSR) est contrôlé par la phosphorylation des motifs. Les motifs d'association 14-3-3 non phosphorylés ne lient pas leurs partenaires : ils doivent d'abord être phosphorylés sur des sérines conservées (Ser 259 et Ser 621) par d'autres protéines kinases. La kinase la plus importante impliquée dans cet événement est la kinase 1 activée par le TGF-bêta (TAK1), et les enzymes dédiées à l'élimination de ces phosphates sont les complexes protéine phosphatase 1 (PP1) et protéine phosphatase 2A (PP2A).
Notez que la liaison 14-3-3 des enzymes Raf n'est pas nécessairement inhibitrice : une fois que Raf est ouvert et dimérise, les 14-3-3 peuvent également se lier en trans , pontant deux kinases et les « menottant » ensemble pour renforcer le dimère, au lieu de les éloigner les uns des autres. D'autres modes d'interactions 14-3-3 avec c-Raf existent également, mais leur rôle n'est pas bien connu.
La dimérisation est un autre mécanisme important pour la régulation de l'activité de c-Raf et requis pour la phosphorylation de la boucle d'activation de Raf . Normalement, seuls les domaines kinases "ouverts" participent à la dimérisation. Contrairement à B-Raf, qui forme facilement des homodimères avec lui-même, c-Raf préfère l'hétérodimérisation avec B-Raf ou KSR1. Les homodimères et les hétérodimères se comportent tous de la même manière. La structure du domaine B-Raf homodimère kinase montre clairement que les boucles d'activation (qui contrôlent l'activité catalytique de toutes les protéines kinases connues) sont positionnées dans une conformation de type actif dans le dimère. Ceci est dû à un effet allostérique de l'autre molécule se liant à la face « arrière » de la kinase ; ces dimères sont symétriques et ont deux sites catalytiques partiellement actifs. A ce stade, l'activité des Raf kinases est faible, et instable.
Pour atteindre une activité complète et stabiliser l'état actif, la boucle d'activation de c-Raf doit être phosphorylée. Les seules kinases actuellement connues pour effectuer cet acte sont les kinases de la famille Raf elles-mêmes. Mais certaines autres kinases, telles que PAK1 peuvent phosphoryler d'autres résidus proches du domaine kinase de c-Raf : le rôle précis de ces kinases auxiliaires est inconnu. Dans le contexte de c-Raf, à la fois c-Raf et KSR1 sont nécessaires pour l'étape de "transphosphorylation". En raison de l'architecture des dimères, cette phosphorylation ne peut avoir lieu qu'en trans (c'est-à-dire qu'un dimère en phosphoryle un autre, dans un complexe transitionnel à quatre chaînons). En interagissant avec les résidus Arg et Lys conservés dans le domaine kinase, les boucles d'activation phosphorylées changent de conformation et deviennent ordonnées, verrouillant de manière permanente le domaine kinase dans un état pleinement actif jusqu'à ce qu'il soit déphosphorylé. Les boucles d'activation phosphorylées rendent également la kinase insensible à la présence de son domaine auto-inhibiteur. Les KSR ne peuvent pas subir cette dernière étape car ils manquent de résidus phosphorylables dans leurs boucles d'activation. Mais une fois que c-Raf est complètement activé, il n'y a plus besoin de le faire : les enzymes Raf actives peuvent désormais engager leurs substrats. Comme la plupart des protéines kinases, c-Raf possède de multiples substrats. La BAD (Bcl2-atagonist of cell death) est directement phosphorylée par le c-Raf, ainsi que plusieurs types d' adénylate cyclase , la myosine phosphatase (MYPT), la troponine T du muscle cardiaque (TnTc), etc. La protéine du rétinoblastome (pRb) et la Cdc25 phosphatase ont également été suggérés comme substrats possibles.
Les cibles les plus importantes de toutes les enzymes Raf sont MKK1(MEK1) et MKK2(MEK2) . Bien que la structure du complexe enzyme-substrat c-Raf:MKK1 soit inconnue, elle peut être précisément modélisée d'après le complexe KSR2:MKK1. Ici, aucune catalyse réelle n'a lieu, mais on pense qu'elle est très similaire à la façon dont Raf se lie à ses substrats. L'interface d'interaction principale est fournie par les lobes C-terminaux des deux domaines de kinase ; la grande boucle désordonnée riche en proline unique à MKK1 et MKK2 joue également un rôle important dans son positionnement par rapport à Raf (et KSR). Ces MKK deviennent phosphorylées sur au moins deux sites dans leurs boucles d'activation lors de la liaison à Raf : cela les activera également. Les cibles de la cascade de kinases sont ERK1 et ERK2, qui sont sélectivement activées par MKK1 ou MKK2. Les ERK ont de nombreux substrats dans les cellules ; ils sont également capables de se déplacer dans le noyau pour activer des facteurs de transcription nucléaires. Les ERK activés sont des effecteurs pléiotropes de la physiologie cellulaire et jouent un rôle important dans le contrôle de l'expression des gènes impliqués dans le cycle de division cellulaire, la migration cellulaire, l'inhibition de l'apoptose et la différenciation cellulaire.
Maladies humaines associées
Des mutations héréditaires de gain de fonction de c-Raf sont impliquées dans certains syndromes rares mais sévères. La plupart de ces mutations impliquent des changements d'acides aminés uniques à l'un des deux motifs de liaison 14-3-3. La mutation de c-Raf est l'une des causes possibles du syndrome de Noonan : les individus atteints ont des malformations cardiaques congénitales, une petite taille et une dysmorphie et plusieurs autres malformations. Des mutations similaires dans c-Raf peuvent également provoquer une affection connexe, appelée syndrome LEOPARD (Lentigo, anomalies électrocardiographiques, hypertélorisme oculaire, sténose pulmonaire, organes génitaux anormaux, retard de croissance, surdité), avec une association complexe de défauts.
Rôle dans le cancer
Bien que c-Raf soit très clairement capable de muter en oncogène en milieu expérimental, et même dans quelques tumeurs humaines, sa sœur kinase B-Raf est le véritable acteur majeur de la cancérogenèse chez l'homme.
Mutations B-Raf
Environ 20 % de tous les échantillons de tumeurs humaines examinés présentent un gène B-Raf muté. L'écrasante majorité de ces mutations implique l'échange d'un seul acide aminé : Val 600 en Glu, et ce produit génique aberrant (BRAF-V600E) peut être visualisé par immunohistochimie pour le diagnostic moléculaire clinique. L'aberration peut imiter la phosphorylation de la boucle d'activation et - par sauter toutes les étapes de contrôle à l'activation normale - rendre immédiatement le domaine kinase pleinement actif. Étant donné que B-Raf peut également s'activer par homodimérisation et c-Raf par hétérodimérisation, cette mutation a un effet catastrophique en rendant la voie ERK1/2 constitutivement active et en entraînant un processus incontrôlé de division cellulaire.
Comme cible thérapeutique
En raison de l'importance des mutations Ras et B-Raf dans la tumorigenèse, plusieurs inhibiteurs de Raf ont été développés pour lutter contre le cancer, en particulier contre B-Raf présentant la mutation V600E. Le sorafénib a été le premier agent cliniquement utile, qui offre une alternative pharmacologique pour traiter des tumeurs malignes auparavant largement incurables, telles que le carcinome rénal et le mélanome. Plusieurs autres molécules suivies, comme vémurafénib , régorafénib , Dabrafenib , etc.
Malheureusement, les inhibiteurs de B-Raf compétitifs avec l'ATP peuvent avoir un effet indésirable dans les cancers dépendants de K-Ras : ils sont tout simplement trop sélectifs pour B-Raf. Alors qu'ils inhibent parfaitement l'activité de B-Raf dans le cas où un B-Raf mutant est le principal coupable, ils favorisent également l'homo- et l'hétérodimérisation de B-Raf, avec lui-même et c-Raf. Cela améliorera en fait l' activation de c-Raf au lieu de l'inhiber au cas où il n'y aurait pas de mutation dans les gènes Raf, mais leur protéine activatrice commune en amont K-Ras est celle qui a muté. Cette activation "paradoxale" de c-Raf nécessite la nécessité de dépister les mutations de B-Raf chez les patients (par diagnostic génétique) avant de commencer une thérapie par inhibiteur de B-Raf.
Liste des protéines en interaction
Il a été démontré que C-Raf interagit avec :
Voir également
Les références
Lectures complémentaires
- Reed JC, Zha H, Aimé-Sempe C, Takayama S, Wang HG (1997). « Analyse structure-fonction des protéines de la famille Bcl-2. Régulateurs de la mort cellulaire programmée ». Av. Exp. Méd. Biol . 406 : 99-112. doi : 10.1007/978-1-4899-0274-0_10 . PMID 8910675 .
- Geyer M, Fackler OT, Peterlin BM (2001). "Relations structure-fonction dans HIV-1 Nef" . Représentant EMBO . 2 (7) : 580-5. doi : 10.1093/embo-reports/kve141 . PMC 1083955 . PMID 11463741 .
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Liens externes
- Entrée GeneReviews/NCBI/NIH/UW sur le syndrome de Noonan
- Diagrammes de structure de domaine pour Raf-1, A-Raf et B-Raf.
- Trou de perche de drosophile - The Interactive Fly
- c-raf+Proteins à la National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) des États-Unis
- Emplacement du génome humain RAF1 et page de détails du gène RAF1 dans le navigateur de génome UCSC .
- Aperçu de toutes les informations structurelles disponibles dans le PDB pour UniProt : P04049 (RAF proto-oncogène sérine/thréonine-protéine kinase) au PDBe-KB .
