c -Raf - c-Raf
RAF protoonkogen serin / threonin-proteinkinasy, také známý jako proto-onkogenu c-Raf nebo jednoduše c-Raf nebo dokonce Raf-1, je enzym , který je u člověka kódována podle RAF1 genem . Protein c-Raf je součástí dráhy ERK1/2 jako MAP kináza (MAP3K), která funguje po proudu od podrodiny Ras membránově asociovaných GTPáz. C-Raf je členem rodiny kináz Raf serin/threonin-specifických proteinových kináz ze skupiny kináz TKL (podobných tyrosin kináze).
Objev
První gen Raf, v-Raf, byl nalezen v roce 1983. Byl izolován z myšího retroviru nesoucího číslo 3611. Brzy se ukázalo, že je schopen transformovat fibroblasty hlodavců na linie rakovinných buněk , proto tento gen dostal název Virus- indukovaný rychle zrychlený fibrosarkom (V-RAF). O rok později byl v ptačí retroviru MH2 nalezen další transformující gen, pojmenovaný v-Mil-který se ukázal být velmi podobný v-Raf. Výzkumníci byli schopni prokázat, že tyto geny kódují enzymy, které mají aktivitu serin-threonin kinázy. Normální buněčné homology v-Raf a v-Mil byly brzy nalezeny jak v myším, tak v kuřecím genomu (odtud název c-Raf pro normální buněčný gen Raf), a bylo jasné, že i tyto mají svou roli v regulaci růstu a buněčné dělení. Nyní víme, že c-Raf je hlavní složkou první popsané dráhy mitogenem aktivované proteinové kinázy (MAPK): signalizace ERK1/2 . Působí jako MAP3 kináza, iniciující celou kinázovou kaskádu. Následné experimenty ukázaly, že normální, buněčné geny Raf mohou také mutovat, aby se staly onkogeny, „přetížením“ aktivity MEK1/2 a ERK1/2. Ve skutečnosti genomy obratlovců obsahují více genů Raf. O několik let později po objevu c-Raf byly popsány další dvě příbuzné kinázy: A-Raf a B-Raf . Posledně jmenovaný se v posledních letech stal středem výzkumu, protože velká část lidských nádorů nese onkogenní mutace „řidiče“ v genu B-Raf. Tyto mutace vyvolávají nekontrolovanou, vysokou aktivitu Raf enzymů. Diagnostický a terapeutický zájem o kinázy Raf dosáhl v posledních letech nového vrcholu.
Struktura
Lidský gen c-Raf se nachází na chromozomu 3 . Byly popsány alespoň dvě izoformy mRNA (vyplývající z inkluze nebo odstranění alternativního exonu ), které vykazují pouze nepatrné rozdíly. Kratší hlavní izoforma - skládající se ze 17 exonů - kóduje protein kinázu o 648 aminokyselinách.
Podobně jako mnoho jiných MAPKKK je c-Raf multidoménový protein s několika dalšími doménami, které pomáhají regulovat jeho katalytickou aktivitu. Na svém N-koncovém segmentu se vedle sebe nacházejí doména vázající Ras (RBD) a C-kinázová homologní doména 1 (doména C1). Struktury obou konzervovaných domén byly v minulých desetiletích vyřešeny, což vrhlo světlo na mechanismy jejich regulace.
Tyto Ras-vazebná doména displeje ubiquitin-like krát (stejně jako mnoho jiných malých G-proteinem sdružujících domény) a selektivně váže pouze GTP-vázané Ras proteiny. (Tuto interakci můžete vidět velmi podrobně v poli PDB připojeném k článku. Ukazuje Rap1 v komplexu s RBD c-Raf.)
Doména C1 - bezprostředně po proudu od Ras vazebná doména - je speciální zinkového prstu , bohaté na cysteiny a stabilizován dvěma ionty zinku. Je podobný C1 doménám diacylglycerolu vázajících enzymy protein kinázy C (PKC). Ale na rozdíl od PKC, C1 domény kináz rodiny Raf neváží diacylglycerol. Místo toho interagují s jinými lipidy, jako je ceramid nebo kyselina fosfatidová, a dokonce pomáhají při rozpoznávání aktivovaného Ras (GTP-Ras).
Blízká blízkost těchto dvou domén a také několik řádků experimentálních dat naznačuje, že působí jako jedna jednotka, která negativně reguluje aktivitu domény protein kinázy přímou fyzickou interakcí. Historicky byl tento autoinhibiční blok označen jako oblast CR1 ("konzervovaná oblast 1"), pantová oblast je pojmenována CR2 a kinázová doména CR3. Přesná struktura autoinhibované kinázy bohužel zůstává neznámá.
Mezi blokem autoinhibiční domény a doménou katalytické kinázy se nachází dlouhý segment - charakteristický pro všechny proteiny Raf. Je vysoce obohacen o serinové aminokyseliny, ale jeho přesná sekvence je v příbuzných genech Raf špatně konzervována. Zdá se, že tato oblast je vnitřně nestrukturovaná a velmi flexibilní. Jeho nejpravděpodobnější rolí je působit jako přirozený „kloub“ mezi pevně složenými autoinhibičními a katalytickými doménami, což umožňuje komplexní pohyby a hluboké konformační přesmyky uvnitř molekuly. Tato pantová oblast obsahuje malý konzervovaný ostrůvek aminokyselin, které jsou zodpovědné za rozpoznávání proteinů 14-3-3 , ale pouze tehdy, je-li fosforylován kritický serin (Ser259 v lidském c-Raf). Druhý podobný motiv se nachází na extrémním C-konci (soustředěném kolem fosforylovatelného Ser 621) všech Raf enzymů, ale za kinázovou doménou.
C-koncová polovina c-Raf se skládá do jediné proteinové domény, která je zodpovědná za katalytickou aktivitu. Struktura této kinázové domény je dobře známá jak z c-Raf, tak z B-Raf. Je velmi podobný jiným kinázám Raf a proteinům KSR a zřetelně podobný některým dalším kinázám MAP3, jako je rodina Mixed Lineage Kinase (MLK). Společně obsahují skupinu proteinových kináz typu Tyrosin Kinase Like (TKL). Ačkoli některé rysy spojují jejich katalytické domény s proteinovými tyrosinkinázami, aktivita TKL je omezena na fosforylaci serinových a threoninových zbytků v cílových proteinech. Nejdůležitějším substrátem Raf kináz (kromě sebe) jsou MKK1 a MKK2 kinázy, jejichž aktivita striktně závisí na fosforylačních událostech prováděných Rafs.
Evoluční vztahy
Lidský c-Raf je členem větší rodiny příbuzných proteinových kináz. Dva další členové - nalezení u většiny obratlovců - patří do stejné rodiny: B -Raf a A -Raf . Kromě rozdílné délky jejich nekonzervovaných N- a C-koncových konců sdílejí všechny stejnou doménovou architekturu, strukturu a regulaci. Ve srovnání s relativně známými c-Raf a B-Raf je velmi málo známo o přesné funkci A-Raf, ale je také myšlenka být podobná jako u ostatních dvou členů rodiny. Předpokládá se, že všechny tyto geny jsou produktem duplikace celého genu nebo genomu na úsvitu evoluce obratlovců z jediného rodového genu Raf. Většina ostatních zvířecích organismů má pouze jeden gen Raf. Jmenuje se Phl nebo Draf u Drosophila a Lin-45 u C. elegans.
Mnohobuněčná zvířata mají také typ kinázy úzce související s Raf: toto je supresor kinázy Ras (KSR). Obratlovci jako savci mají místo jednoho dva paralogické geny KSR: KSR1 a KSR2 . Jejich doména C-terminální kinázy je velmi podobná Raf (původně nazývaná CA5 v KSR a CR3 v Raf), ale regulační oblast N-konce se liší. Přestože mají před sebou také flexibilní kloub (CA4 v KSR) a doménu C1 (CA3 v KSR), KSR zcela postrádají doménu vázající Ras. Místo toho mají na svých N-koncích jedinečné regulační oblasti, původně označované jako CA1 („konzervovaná oblast 1“) a CA2. Struktura domény CA1 byla dlouhou dobu záhadou. V roce 2012 však byla vyřešena struktura oblasti CA1 v KSR1: ukázalo se, že jde o divergentní doménu SAM (sterilní motiv alfa), doplněnou o vinuté cívky (CC-SAM): má to pomoci KSR v membráně vazba. KSR, stejně jako Rafs, mají také dvojče asociační motivy 14-3-3 (které závisí na fosforylaci), ale také mají na svých kloubových oblastech nové motivy vázající MAPK. S typickou sekvencí Phe-x-Phe-Pro (FxFP) jsou tyto motivy důležité pro regulaci zpětné vazby Raf kináz v dráze ERK1/2 . Podle našich současných znalostí se KSR účastní stejné cesty jako Raf, ačkoli hrají pouze pomocnou roli. S velmi špatnou vnitřní kinázovou aktivitou se dlouho myslelo, že jsou neaktivní, dokud se jejich katalytická aktivita v posledních letech konečně neprokázala. Ale i tak přispívají k fosforylaci MKK1 a MKK2 jen zanedbatelně . Zdá se, že hlavní úlohou KSR je poskytnout heterodimerizačního partnera enzymům Raf, což výrazně usnadňuje jejich aktivaci pomocí alostery. Podobné jevy byly popsány pro jiné MAP3 kinázy. Například ASK2 je sám o sobě špatným enzymem a jeho aktivita se zdá být svázána s heterodimerizací ASK1/ASK2.
Raf-like kinázy v houbách zcela chybí. Nedávné sekvenování jiných opisthokontů (např. Capsaspora owczarzaki ) však odhalilo přítomnost pravých Raf kináz v jednobuněčných eukaryotech. Proto je možné, že proteiny Raf jsou starodávným dědictvím a předkové hub sekundárně ztratili Raf-dependentní signalizaci. Plísňové MAP kinázové dráhy, které jsou homologické k savčí dráze ERK1/2 (Fus3 a Kss1 v kvasinkách) jsou aktivovány kinázami příbuznými s MEKK (např. Ste11 v kvasinkách) namísto Raf enzymů.
Raf kinázy nalezené v retrovirech (jako je myší v-Raf) jsou sekundárně odvozeny z odpovídajících genů obratlovců jejich hostitelů. Tyto geny Raf kódují silně zkrácené proteiny, kterým chybí celá N-koncová autoinhibiční doména, a vazebné motivy 14-3-3. Je známo, že takováto závažná zkrácení indukují nekontrolovanou aktivitu Raf kináz: to je přesně to, co virus může potřebovat pro efektivní reprodukci.
Regulace činnosti
Jak bylo uvedeno výše, regulace aktivity c-Raf je složitá. Jako „strážce brány“ cesty ERK1/2 je udržován pod kontrolou mnoha inhibičními mechanismy a normálně jej nelze aktivovat v jediném kroku. Nejdůležitější regulační mechanismus zahrnuje přímou, fyzickou asociaci N-koncového autoinhibičního bloku s kinázovou doménou c-Raf. Výsledkem je okluze katalytického místa a úplné vypnutí kinázové aktivity. Tento „uzavřený“ stav lze zmírnit pouze tehdy, pokud autoinhibiční doména Raf zapojí partnera konkurujícího vlastní kinázové doméně, nejdůležitější je GTP vázaný Ras. Aktivované malé G-proteiny tak mohou rozbít intramolekulární interakce: to má za následek konformační změnu („otevření“) c-Raf nezbytnou pro aktivaci kinázy a vazbu substrátu.
14-3-3 proteiny také přispívají k autoinhibici. Protože je známo, že 14-3-3 proteiny tvoří konstitutivní dimery, jejich sestavy mají dvě vazebná místa. Dimer tedy funguje jako „molekulární pouta“, která blokuje jejich vazebné partnery v pevné vzdálenosti a orientaci. Když jsou přesně umístěné dvojité vazebné motivy 14-3-3 zapojeny jediným dimerem 14-3-3 proteinu (jako je 14-3-3 zeta), dojde k jejich zablokování do konformace, která podporuje autoinhibici a neumožňuje uvolnění autoinhibiční a katalytické domény. Toto „zablokování“ c-Raf (a dalších Rafů a také KSR) je řízeno fosforylací motivu. Nefosforylované asociační motivy 14-3-3 neváží své partnery: potřebují se nejprve fosforylovat na konzervovaných serinech (Ser 259 a Ser 621) jinými proteinovými kinázami. Nejdůležitější kinázou implikovanou v tomto případě je TGF-beta aktivovaná kináza 1 (TAK1) a enzymy určené pro odstranění těchto fosfátů jsou komplexy protein fosfatázy 1 (PP1) a protein fosfatázy 2A (PP2A).
Vazba enzymů Raf 14-3-3 nemusí být nutně inhibiční: jakmile je Raf otevřený a dimerizuje, 14-3-3s se mohou také vázat v trans , přemosťovat dvě kinázy a „spoutat“ je dohromady, aby se posílil dimer, místo držet je dál od sebe. Existují také další způsoby interakcí 14-3-3 s c-Raf, ale jejich role není dobře známá.
Dimerizace je dalším důležitým mechanismem pro regulaci aktivity c-Raf a je nutná pro fosforylaci aktivační smyčky Raf . Normálně se dimerizace účastní pouze „otevřené“ kinázové domény. Na rozdíl od B-Raf, který se sebou samočinně vytváří homodimery, c-Raf preferuje heterodimerizaci buď s B-Raf nebo KSR1. Homodimery a heterodimery se chovají podobně. Struktura domény homodimer kinázy B-Raf jasně ukazuje, že aktivační smyčky (které kontrolují katalytickou aktivitu všech známých proteinových kináz) jsou umístěny v aktivně podobné konformaci v dimeru. To je způsobeno alosterickým účinkem vazby jiné molekuly na „zadní“ stranu kinázy; tyto dimery jsou symetrické a mají dvě, částečně aktivní katalytická místa. V této fázi je aktivita kináz Raf nízká a nestabilní.
K dosažení plné aktivity a stabilizaci aktivního stavu je třeba aktivační smyčku c-Raf fosforylovat. Jediné kinázy, o nichž je v současnosti známo, že provádějí tento akt, jsou samotné kinázy rodiny Raf. Ale některé další kinázy, jako je PAK1, mohou fosforylovat jiné zbytky v blízkosti kinázové domény c-Raf: přesná role těchto pomocných kináz není známa. V kontextu c-Raf jsou pro krok „transfosforylace“ zapotřebí jak c-Raf, tak KSR1. Vzhledem k architektuře dimerů může tato fosforylace probíhat pouze v trans (tj. Jeden dimer fosforyluje druhý, ve čtyřčlenném přechodném komplexu). Interakce s konzervovanými zbytky Arg a Lys v kinázové doméně posouvají fosforylované aktivační smyčky konformaci a stanou se uspořádanými, čímž trvale uzamknou kinázovou doménu do plně aktivního stavu až do defosforylace. Fosforylované aktivační smyčky také činí kinázu necitlivou na přítomnost její autoinhibiční domény. KSR nemohou tento poslední krok podstoupit, protože ve svých aktivačních smyčkách postrádají jakékoli fosforylovatelné zbytky. Ale jakmile je c-Raf plně aktivován, není třeba to dále dělat: aktivní Raf enzymy nyní mohou zapojit své substráty. Jako většina proteinových kináz má i c-Raf více substrátů. BAD (Bcl2-atagonista buněčné smrti) je přímo fosforylován c-Raf spolu s několika typy adenylátcykláz , myosin fosfatázou (MYPT), troponinem srdečního svalu (TnTc) atd. Retinoblastomový protein (pRb) a Cdc25 fosfatáza byly také navrženy jako možné substráty.
Nejdůležitějšími cíli všech enzymů Raf jsou MKK1 (MEK1) a MKK2 (MEK2) . Ačkoli struktura komplexu enzym-substrát c-Raf: MKK1 není známa, lze jej přesně modelovat podle komplexu KSR2: MKK1. Zde žádná skutečná katalýza neprobíhá, ale předpokládá se, že je velmi podobná způsobu, jakým se Raf váže na své substráty. Hlavní interakční rozhraní zajišťují C-koncové laloky obou kinázových domén; velká neuspořádaná smyčka bohatá na prolin jedinečná pro MKK1 a MKK2 také hraje důležitou roli v jejím umístění na Raf (a KSR). Tyto MKK se po navázání na Raf fosforylují alespoň na dvou místech v jejich aktivačních smyčkách: tím se také aktivují. Cíle kinázové kaskády jsou ERK1 a ERK2, které jsou selektivně aktivovány MKK1 nebo MKK2. ERK mají v buňkách mnoho substrátů; jsou také schopné translokace do jádra, aby aktivovaly nukleární transkripční faktory. Aktivované ERK jsou pleiotropní efektory buněčné fyziologie a hrají důležitou roli v řízení genové exprese zapojené do cyklu buněčného dělení, migrace buněk, inhibice apoptózy a buněčné diferenciace.
Přidružené lidské choroby
Dědičné mutace c-Raf pro získání funkce jsou zapojeny do některých vzácných, ale závažných syndromů. Většina těchto mutací zahrnuje změny jedné aminokyseliny na jednom ze dvou vazebných motivů 14-3-3. Mutace c-Raf je jednou z možných příčin Noonanova syndromu : postižení jedinci mají vrozené srdeční vady, krátkou a dysmorfickou postavu a několik dalších deformit. Podobné mutace v c-Raf mohou také způsobit související stav, nazývaný syndrom LEOPARD (Lentigo, elektrokardiografické abnormality, oční hypertelorismus, plicní stenóza, abnormální genitálie, retardovaný růst, hluchota), s komplexním sdružením defektů.
Role v rakovině
Ačkoli c-Raf je v experimentálních podmínkách velmi jasně schopen mutace na onkogen, a dokonce i v několika lidských nádorech, jeho sesterská kináza B-Raf je skutečným hlavním hráčem v karcinogenezi u lidí.
B-Raf mutace
Přibližně 20% všech zkoumaných vzorků lidských nádorů vykazuje mutovaný gen B-Raf. Drtivá většina těchto mutací zahrnuje výměnu jedné aminokyseliny: Val 600 za Glu a tento aberantní genový produkt (BRAF -V600E) lze vizualizovat pomocí imunohistochemie pro klinickou molekulární diagnostiku Aberace může napodobovat fosforylaci aktivační smyčky a - přeskočení všech řídicích kroků při normální aktivaci - okamžitě udělejte kinázovou doménu plně aktivní. Protože se B-Raf může aktivovat také homodimerizací a c-Raf heterodimerizací, má tato mutace katastrofický účinek tím, že se dráha ERK1/2 stává konstitutivně aktivní a řídí nekontrolovaný proces dělení buněk.
Jako terapeutický cíl
Vzhledem k důležitosti mutací Ras i B-Raf v tumorigenezi bylo vyvinuto několik inhibitorů Raf k boji proti rakovině, zejména proti B-Raf vykazujícím mutaci V600E. Sorafenib byl prvním klinicky užitečným činidlem, které poskytuje farmakologickou alternativu k léčbě dříve do značné míry neléčitelných malignit, jako je karcinom ledvin a melanom. Následovalo několik dalších molekul, jako je Vemurafenib , Regorafenib , Dabrafenib atd.
ATP-kompetitivní inhibitory B-Raf mohou mít nežádoucí účinek u rakovin závislých na K-Ras: Pro B-Raf jsou prostě příliš selektivní. I když dokonale dobře inhibují aktivitu B-Raf v případě, že primárním viníkem je mutant B-Raf, podporují také homo- a heterodimerizaci B-Raf, samotného a c-Raf. To ve skutečnosti zvýší aktivaci c-Raf namísto její inhibice v případě, že v žádných genech Raf nedojde k mutaci, ale jejich společný upstream aktivátorový protein K-Ras je mutovaný. Tato „paradoxní“ aktivace c-Raf vyžaduje, aby byla před zahájením léčby inhibitorem B-Raf u pacientů (genetická diagnostika) vyšetřena mutace B-Raf.
Seznam interagujících proteinů
Bylo ukázáno, že C-Raf interaguje s:
Viz také
Reference
Další čtení
- Reed JC, Zha H, Aime-Sempe C, Takayama S, Wang HG (1997). "Strukturně-funkční analýza proteinů rodiny Bcl-2. Regulátory programované buněčné smrti". Adv. Exp. Med. Biol . 406 : 99–112. doi : 10.1007/978-1-4899-0274-0_10 . PMID 8910675 .
- Geyer M, Fackler OT, Peterlin BM (2001). „Vztahy mezi strukturou a funkcí v HIV-1 Nef“ . EMBO Rep . 2 (7): 580–5. doi : 10.1093/embo-reports/kve141 . PMC 1083955 . PMID 11463741 .
- Dhillon AS, Kolch W (2002). „Rozvázání regulace kinázy Raf-1“. Oblouk. Biochem. Biofy . 404 (1): 3–9. doi : 10,1016/S0003-9861 (02) 00244-8 . PMID 12127063 .
- Greenway AL, Holloway G, McPhee DA, Ellis P, Cornall A, Lidman M (2004). „HIV-1 Nef kontrola buněčných signálních molekul: více strategií na podporu replikace viru“. J. Biosci . 28 (3): 323–35. doi : 10,1007/BF02970151 . PMID 12734410 . S2CID 33749514 .
- Chen H, Kunnimalaiyaan M, Van Gompel JJ (2006). „Medulární rakovina štítné žlázy: funkce raf-1 a lidského homologu achaete-scute-1“. Štítné žlázy . 15 (6): 511–21. doi : 10,1089/tvé . 2005.15.511 . PMID 16029117 .
externí odkazy
- Záznam GeneReviews/NCBI/NIH/UW o Noonan syndromu
- Schémata struktury domény pro Raf-1, A-Raf a B-Raf.
- Otvor pro pól Drosophila - Interaktivní muška
- c-raf+Proteiny v USA National Library of Medicine Lékařská témata (MeSH)
- Poloha genomu lidského RAF1 a stránka podrobností genu RAF1 v prohlížeči genomu UCSC .
- Přehled všech strukturálních informací dostupných v PDB pro UniProt : P04049 (RAF proto- onkogenová serin/threonin-protein kinasa) na PDBe-KB .
