Proteiinitekniikka - Protein engineering

Proteiinitekniikka on hyödyllisten tai arvokkaiden proteiinien kehittämisprosessi . Se on nuori tieteenala, jossa tutkitaan paljon proteiinien taittumisen ymmärtämistä ja proteiinien suunnitteluperiaatteiden tunnustamista . Se on myös tuote- ja palvelumarkkinat, joiden arvioitu arvo on 168 miljardia dollaria vuoteen 2017 mennessä.

Proteiinitekniikalle on kaksi yleistä strategiaa: järkevä proteiinisuunnittelu ja suunnattu evoluutio . Nämä menetelmät eivät sulje pois toisiaan; tutkijat soveltavat usein molempia. Tulevaisuudessa proteiinirakenteen ja -toiminnon tarkempi tuntemus sekä korkean suorituskyvyn seulonnan edistyminen voivat laajentaa suuresti proteiinitekniikan kykyjä. Lopulta jopa luonnottomia aminohappoja voidaan sisällyttää uudempien menetelmien, kuten laajennetun geneettisen koodin , avulla, jotka mahdollistavat uusien aminohappojen koodaamisen geneettiseen koodiin.

Lähestyy

Rationaalinen suunnittelu

Rationaalisessa proteiinisuunnittelussa tutkija käyttää yksityiskohtaista tietoa proteiinin rakenteesta ja toiminnasta haluttujen muutosten tekemiseksi. Tämän etuna on yleensä se, että se on halpaa ja teknisesti helppoa, koska kohdennetut mutageneesimenetelmät ovat hyvin kehittyneitä. Sen tärkein haittapuoli on kuitenkin se, että yksityiskohtaista rakenteellista tietoa proteiinista ei usein ole saatavissa, ja jopa silloin, kun se on saatavilla, voi olla vaikea ennustaa erilaisten mutaatioiden vaikutuksia, koska rakenteelliset tiedot antavat useimmiten staattisen kuvan proteiinirakenteesta. Kuitenkin, ohjelmat, kuten Folding @ home ja Foldit ovat hyödyntäneet crowdsourcing tekniikoita, jotta voidaan saada käsityksen kääntyvät kuviot proteiineja.

Laskennallinen proteiinin suunnittelu algoritmit yrittävät tunnistaa uusia aminohapposekvenssejä, jotka ovat vähän energiaa taitettuna ennalta määritelty tavoite rakenne. Vaikka etsittävä sekvenssi-konformaatiotila on suuri, laskennallisen proteiinisuunnittelun haastavin vaatimus on nopea, mutta tarkka energiatoiminto, joka pystyy erottamaan optimaaliset sekvenssit vastaavista suboptimaalisista.

Useiden sekvenssien tasaus

Ilman rakenteellista tietoa proteiinista, sekvenssianalyysi on usein hyödyllinen proteiinin informaation selvittämiseksi. Nämä tekniikat käsittävät kohdeproteiinisekvenssien kohdistamisen muihin vastaaviin proteiinisekvensseihin. Tämä kohdistus voi osoittaa, mitkä aminohapot ovat konservoituneet lajien välillä ja ovat tärkeitä proteiinin toiminnalle. Nämä analyysit voivat auttaa tunnistamaan kuumapisteen aminohapot, jotka voivat toimia mutaatioiden kohdepaikoina. Usean sekvenssin tasaus käyttää tietokantoja, kuten PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE ja BALIBASE, jotta voidaan ristittää kohdeproteiinisekvenssit tunnettujen sekvenssien kanssa. Useita sekvenssin kohdistustekniikoita on lueteltu alla.

Tämä menetelmä alkaa suorittamalla sekvenssit pareittain k-tuple- tai Needleman – Wunsch- menetelmillä. Nämä menetelmät laskevat matriisin, joka kuvaa parin samankaltaisuuden sekvenssipareiden välillä. Samankaltaisuuspisteet muunnetaan sitten etäisyyspisteiksi, joita käytetään tuottamaan ohjauspuu käyttäen naapuriliitäntämenetelmää. Tätä ohjauspuuta käytetään sitten tuottamaan useita sekvenssejä.

Clustal omega

Tämä menetelmä pystyy kohdistamaan jopa 190 000 sekvenssiä käyttämällä k-tuple-menetelmää. Seuraava ovat ryhmittyneet käyttäen mBed ja k välineet menetelmiä. Tämän jälkeen ohjauspuu rakennetaan UPGMA- menetelmällä, jota HH-kohdistuspaketti käyttää. Tätä ohjepuuta käytetään useiden sekvenssirivistysten luomiseen.

MAFFT

Tässä menetelmässä käytetään nopeaa Fourier-muunnosta (FFT), joka muuntaa aminohapposekvenssit sekvenssiksi, joka koostuu kunkin aminohappotähteen tilavuus- ja napaisuusarvoista. Tätä uutta sekvenssiä käytetään homologisten alueiden löytämiseen.

K-kohdista

Tämä menetelmä käyttää Wu-Manberin likimääräistä merkkijonojen sovitusalgoritmia useiden sekvenssialgointien luomiseen.

Useiden sekvenssien vertailu log-odotuksella (MUSCLE)

Tämä menetelmä käyttää Kmerin ja Kimuran etäisyyksiä useiden sekvenssirivistysten luomiseen.

T-kahvi

Tämä menetelmä käyttää puupohjaisia ​​johdonmukaisuuden tavoitetoimintoja tasaamisen evoluutiossa. Tämän menetelmän on osoitettu olevan 5-10% tarkempi kuin Clustal W.

Coevolutionary-analyysi

Koevoluutioanalyysi tunnetaan myös korreloituneena mutaationa, kovariaationa tai rinnakkaissubstituutiona. Tämän tyyppiseen järkevään suunnitteluun liittyy vastavuoroisia evoluutiomuutoksia evoluutiolla vuorovaikutuksessa olevilla lokuksilla. Yleensä tämä menetelmä alkaa kuratoitujen usean sekvenssin kohdistusten luomisella kohdesekvenssille. Tämä linjaus puhdistetaan sitten manuaalisesti, johon sisältyy erittäin aukkojen sekvenssien sekä sekvenssien, joilla on pieni sekvenssi-identtisyys, poistaminen. Tämä vaihe parantaa kohdistuksen laatua. Seuraavaksi manuaalisesti käsiteltyä kohdistusta käytetään lisäkoevoluutioarvoisiin mittauksiin käyttämällä erillisiä korreloivia mutaatioalgoritmeja. Nämä algoritmit johtavat coevolution-pisteytysmatriisiin. Tämä matriisi suodatetaan soveltamalla erilaisia ​​merkitsevyystestejä merkittävien koevoluutioarvojen poimimiseksi ja taustamelun pyyhkimiseksi. Koevoluutiomittauksia arvioidaan edelleen niiden suorituskyvyn ja tiukkuuden arvioimiseksi. Lopuksi tämän koevoluutioanalyysin tulokset validoidaan kokeellisesti.

Rakenteellinen ennuste

De novo -proteiinisynteesi hyötyy olemassa olevien proteiinirakenteiden tuntemisesta. Tämä tieto olemassa olevasta proteiinirakenteesta auttaa ennustamaan uusia proteiinirakenteita. Menetelmät proteiinirakenteen ennustamiseksi kuuluvat yhteen neljästä seuraavasta luokasta: ab initio, fragmenttipohjaiset menetelmät, homologiamallinnus ja proteiinilangoitus.

AB initio

Näihin menetelmiin sisältyy ilmainen mallinnus ilman mallin rakenteellisia tietoja. Ab initio -menetelmillä pyritään ennustamaan proteiinien natiivirakenteet, jotka vastaavat sen vapaan energian globaalia minimia. joitain esimerkkejä ab initio -menetelmistä ovat AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS ja ENCEPP12. Ab initio -menetelmien yleiset vaiheet alkavat kiinnostavan proteiinin geometrisen esityksen. Seuraavaksi kehitetään proteiinin potentiaalinen energiafunktiomalli. Tämä malli voidaan luoda käyttämällä joko molekyylimekaniikan potentiaalia tai proteiinirakenteesta johdettuja potentiaalifunktioita. Potentiaalisen mallin kehittämisen jälkeen proteiiniin sovelletaan energianhakutekniikoita, mukaan lukien molekyylidynaamiset simulaatiot, Monte Carlon simulaatiot ja geneettiset algoritmit.

Sirpalepohjainen

Nämä menetelmät käyttävät rakenteita koskevaa tietokantatietoa homologisten rakenteiden sovittamiseksi luotuihin proteiinisekvensseihin. Nämä homologiset rakenteet on koottu antamaan pienikokoiset rakenteet pisteytys- ja optimointimenettelyjen avulla tavoitteenaan pienin potentiaalinen energiapiste. Fragmenttitietojen verkkopalvelimet ovat I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM ja ANGLOR.

Homologian mallinnus

Nämä menetelmät perustuvat proteiinien homologiaan. Nämä menetelmät tunnetaan myös vertailevana mallinnuksena. Ensimmäinen vaihe homologiamallinnuksessa on yleensä tunnetun rakenteen templaattisekvenssien tunnistaminen, jotka ovat homologisia kyselysekvenssille. Seuraavaksi kyselyjakso kohdistetaan mallijärjestykseen. Kohdistuksen jälkeen rakenteellisesti konservoituneet alueet mallinnetaan mallipohjaa käyttäen. Tätä seuraa mallin ulkopuolisten sivuketjujen ja silmukoiden mallinnus. Lopuksi mallinnettua rakennetta parannetaan ja arvioidaan. Palvelimet, jotka ovat käytettävissä homologisen mallinnuksen tietoihin, on lueteltu tässä: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA ja I-TASSER.

Proteiinien langoittaminen

Proteiinilangoitusta voidaan käyttää, kun kyselysekvenssille ei löydy luotettavaa homologia. Tämä menetelmä alkaa hankkimalla kyselysekvenssi ja mallirakenteiden kirjasto. Seuraavaksi kyselyjärjestys ketjutetaan tunnettujen mallirakenteiden päälle. Nämä ehdokasmallit pisteytetään pisteytystoimintojen avulla. Nämä pisteytetään sekä kyselyn että mallisekvenssin potentiaalisten energiamallien perusteella. Tämän jälkeen valitaan ottelu, jolla on pienin potentiaalinen energiamalli. Menetelmät ja palvelimet ketjutiedon noutamiseksi ja laskelmien suorittamiseksi on lueteltu tässä: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP-palvelin, Sparks-X, SEGMER, THREADER2 ESB, , RAPTOR, COTH, MUSTER.

Lisätietoja rationaalisesta suunnittelusta on kohdennetussa mutageneesissä .

Suunnattu evoluutio

Suuntautuneessa evoluutiossa satunnaista mutageneesiä , esim. Virhealtista PCR: ää tai sekvenssisaturaatiomutageneesiä , sovelletaan proteiiniin, ja valintamenetelmää käytetään varianttien valitsemiseksi, joilla on halutut piirteet. Sitten käytetään muita mutaatio- ja selektiokierroksia. Tämä menetelmä jäljittelee luonnollista evoluutiota ja tuottaa yleensä parempia tuloksia kuin järkevä suunnittelu. Lisätty prosessi, jota kutsutaan DNA: n sekoittamiseksi , sekoittaa ja sovittaa onnistuneiden varianttien palat parempien tulosten tuottamiseksi. Tällaiset prosessit jäljittelevät rekombinaatiota, joka tapahtuu luonnollisesti seksuaalisen lisääntymisen aikana . Suunnatun evoluution edut ovat, että se ei vaadi ennakko-informaatiota proteiinista, eikä ole tarpeen pystyä ennustamaan, millainen vaikutus tietyllä mutaatiolla on. Suunnattujen evoluutiokokeiden tulokset ovat todellakin usein yllättäviä, koska halutut muutokset johtuvat usein mutaatioista, joilla ei odoteta olevan mitään vaikutusta. Haittana on, että ne edellyttävät suuritehoista seulontaa , mikä ei ole mahdollista kaikille proteiineille. Suuret määrät rekombinantti-DNA: ta on mutatoitava ja tuotteet on tutkittava haluttujen ominaisuuksien suhteen. Suuri määrä vaihtoehtoja vaatii usein kalliita robottilaitteita prosessin automatisoimiseksi. Kaikkia haluttuja aktiviteetteja ei voida lisäksi seuloa helposti.

Luonnollista darwinilaista evoluutiota voidaan jäljitellä tehokkaasti laboratoriossa kohti proteiinien ominaisuuksien räätälöintiä erilaisiin sovelluksiin, mukaan lukien katalyysi. On olemassa monia kokeellisia tekniikoita suurten ja monipuolisten proteiinikirjastojen tuottamiseksi ja taitettujen, toiminnallisten varianttien seulomiseksi tai valitsemiseksi. Taitetut proteiinit syntyvät yllättävän usein satunnaisessa sekvenssitilassa, joka on hyödynnettävissä kehittyvissä selektiivisissä sideaineissa ja katalyytteissä. Vaikka konservatiivinen kuin suora valinta syväsekvenssitilasta, olemassa olevien proteiinien uudelleensuunnittelu satunnaisella mutageneesillä ja selektiolla / seulonnalla on erityisen vankka menetelmä olemassa olevien ominaisuuksien optimoimiseksi tai muuttamiseksi. Se on myös erinomainen lähtökohta kunnianhimoisempien suunnittelutavoitteiden saavuttamiseksi. Kokeellisen evoluution yhdistäminen nykyaikaisiin laskennallisiin menetelmiin on todennäköisesti laajin ja hedelmällisin strategia luonnolle tuntemattomien toiminnallisten makromolekyylien tuottamiseksi.

Laadukkaiden mutanttikirjastojen suunnittelun tärkeimmät haasteet ovat osoittaneet merkittävää edistystä lähiaikoina. Tämä edistys on ollut parempana kuvauksena mutaatiokuormien vaikutuksista proteiinipiirteisiin. Myös laskennalliset lähestymistavat ovat osoittaneet suuria edistysaskeleita lukemattomasti suuressa sekvenssitilassa hallittavampiin seulontakokoihin, mikä on luonut älykkäitä mutanttikirjastoja. Kirjaston koko on myös pienennetty seulottavampiin kokoihin tunnistamalla tärkeimmät hyödylliset tähteet käyttämällä järjestelmällisen rekombinaation algoritmeja. Lopuksi merkittävä askel eteenpäin kohti entsyymien tehokasta uudelleensuunnittelua on tehty kehittämällä tarkempia tilastollisia malleja ja algoritmeja, jotka kvantifioivat ja ennustavat kytkettyjen mutaatioiden vaikutukset proteiinitoimintoihin.

Yleensä suunnattu evoluutio voidaan tiivistää iteratiivisena kaksivaiheisena prosessina, joka käsittää proteiinimutanttikirjastojen muodostamisen, ja suuritehoisilla seulontaprosesseilla sellaisten varianttien valitsemiseksi, joilla on parannetut piirteet. Tämä tekniikka ei vaadi ennakkotietoa proteiinirakenteesta ja funktion suhteesta. Suunnattu evoluutio käyttää satunnaista tai kohdennettua mutageneesiä mutanttiproteiinien kirjastojen tuottamiseksi. Satunnaiset mutaatiot voidaan lisätä joko virhealtista PCR: ää tai paikan saturaatiomutageneesiä käyttäen. Mutantteja voidaan myös tuottaa käyttämällä useiden homologisten geenien rekombinaatiota. Luonto on kehittänyt rajoitetun määrän hyödyllisiä sekvenssejä. Suunnattu evoluutio mahdollistaa tunnistamattomien proteiinisekvenssien tunnistamisen, joilla on uusia toimintoja. Tämä kyky riippuu proteiinien kyvystä sietää aminohappotähteiden substituutioita vaarantamatta taittumista tai stabiilisuutta.

Suunnatut evoluutiomenetelmät voidaan luokitella laajasti kahteen strategiaan, seksuaalisiin ja seksuaalisiin menetelmiin.

Seksuaaliset menetelmät

Homoseksuaaliset menetelmät eivät synny mitään ristisidoksia vanhempaingeenien välillä. Yksittäisiä geenejä käytetään mutanttikirjastojen luomiseen käyttämällä erilaisia ​​mutageenitekniikoita. Nämä aseksuaaliset menetelmät voivat tuottaa joko satunnaista tai kohdennettua mutageneesiä.

Satunnainen mutageneesi

Satunnaiset mutageeniset menetelmät tuottavat mutaatioita satunnaisesti kaikkialla kiinnostavassa geenissä. Satunnainen mutageneesi voi tuoda esiin seuraavan tyyppisiä mutaatioita: siirtymiä, transversioita, insertioita, deleetioita, inversioita, missensejä ja hölynpölyä. Alla on esimerkkejä menetelmistä satunnaisen mutageneesin tuottamiseksi.

Virhe altis PCR

Virheelle alttiissa PCR: ssä käytetään tosiasiaa, että Taq-DNA-polymeraasilla ei ole 3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuutta. Tämän seurauksena virhesuhde on 0,001-0,002% / nukleotidi / replikaatio. Tämä menetelmä alkaa valitsemalla geeni tai alue geenissä, jonka halutaan mutatoida. Seuraavaksi vaadittavan virheen laajuus lasketaan sen toiminnan tyypin ja laajuuden perusteella, jonka haluat luoda. Tämä virheen laajuus määrittää virhealtista PCR-strategiaa käytettäväksi. PCR: n jälkeen geenit kloonataan plasmidiin ja viedään kompetentteihin solujärjestelmiin. Nämä solut seulotaan sitten haluttujen ominaisuuksien suhteen. Plasmidit eristetään sitten pesäkkeille, joilla on parantuneet piirteet, ja niitä käytetään sitten malleina seuraavalla mutageneesikierroksella. Virhealtista PCR-testi osoittaa tiettyjen mutaatioiden harhaa suhteessa muihin. Kuten poikkeamat siirtymien yli poikittaisista.

PCR-virhesuhteita voidaan lisätä seuraavilla tavoilla:

1. Lisää magnesiumkloridipitoisuutta, joka stabiloi ei-komplementaarisen emäsparin muodostumisen.
2. Lisää mangaanikloridia emäsparispesifisyyden vähentämiseksi.
3. Lisätty ja epätasapainoinen dNTP: n lisääminen.
4. Perusanalogien, kuten dITP, 8 okso-dGTP ja dPTP, lisääminen.
5. Lisää Taq-polymeraasin pitoisuutta.
6. Lisää pidennysaikaa.
7. Lisää jaksoaikaa.
8. Käytä vähemmän tarkkaa Taq-polymeraasia.

Katso lisätietoja myös polymeraasiketjureaktiosta .

Liikkuvan ympyrän virheellinen PCR

Tämä PCR-menetelmä perustuu liikkuvan ympyrän monistukseen, joka on mallinnettu menetelmästä, jota bakteerit käyttävät pyöreän DNA: n monistamiseen. Tämä menetelmä johtaa lineaarisiin DNA-duplekseihin. Nämä fragmentit sisältävät tandem-toistoja pyöreästä DNA: sta, jota kutsutaan konkatameereiksi, jotka voidaan muuntaa bakteerikannoiksi. Mutaatiot lisätään kloonaamalla ensin kohdesekvenssi sopivaan plasmidiin. Seuraavaksi monistusprosessi alkaa käyttää satunnaisia ​​heksameerialukkeita ja ~ 29-DNA-polymeraasia virheellisissä vierintäympyrän monistusolosuhteissa. Lisäehtoja tuottaa virhealtista rolling circle monistus ovat 13:05 templaatti-DNA, 1,5 mM MnCl ₂ ja 24 tunnin reaktioaikaa. MnCl ₂ lisätään reaktioseokseen edistää satunnainen pistemutaatioita DNA-säikeet. Mutaatio määrää voidaan lisätä lisäämällä pitoisuus MnCI ₂ , tai vähentämällä pitoisuuden templaatti-DNA. Virhealtti vierintäkehän monistus on edullista verrattuna virhealttiiseen PCR: ään, koska siinä käytetään yleisiä satunnaisia ​​heksameerialukkeita spesifisten alukkeiden sijaan. Myöskään tämän amplifikaation reaktiotuotteita ei tarvitse käsitellä ligaaseilla tai endonukleaaseilla. Tämä reaktio on isoterminen.

Kemiallinen mutageneesi

Kemialliseen mutageneesiin sisältyy kemiallisten aineiden käyttö mutaatioiden viemiseksi geneettisiin sekvensseihin. Seuraavassa on esimerkkejä kemiallisista mutageeneista.

Natriumbisulfaatti on mutaatioon tehokas G / C-rikkaissa genomisekvensseissä. Tämä johtuu siitä, että natriumbisulfaatti katalysoi metyloimattoman sytosiinin deaminoitumisen urasiiliksi.

Etyylimetaanisulfonaattialkylaatit guanidiinitähteet. Tämä muutos aiheuttaa virheitä DNA-replikaation aikana.

Typpihappo aiheuttaa transversiota de-aminoimalla adeniinia ja sytosiinia.

Kaksinkertainen lähestymistapa satunnaiseen kemialliseen mutageneesiin on iteratiivinen kaksivaiheinen prosessi. Ensin siihen liittyy mielenkiinnon kohteena olevan geenin kemiallinen mutageneesi in vivo EMS: n kautta. Seuraavaksi käsitelty geeni eristetään ja kloonataan käsittelemättömään ekspressiovektoriin mutaatioiden estämiseksi plasmidirungossa. Tämä tekniikka säilyttää plasmidien geneettiset ominaisuudet.

Glykosylaasien kohdentaminen sulautettuihin ryhmiin mutageneesille (TaGTEAM)

Tätä menetelmää on käytetty luomaan kohdennettu in vivo mutageneesi hiivassa. Tämä menetelmä käsittää 3-metyyliadeniini-DNA-glykosylaasin fuusion tetR-DNA: ta sitovaan domeeniin. Tämän on osoitettu lisäävän mutaatioasteita yli 800 kertaa genomin alueilla, jotka sisältävät tetO-kohtia.

Mutageneesi satunnaisella lisäyksellä ja poistolla

Tämä menetelmä sisältää sekvenssin pituuden muuttamisen poistamalla ja lisäämällä mielivaltaisen pituisten emästen palasia samanaikaisesti. Tämän menetelmän on osoitettu tuottavan proteiineja, joilla on uusia funktionaalisuuksia, lisäämällä uusia restriktiokohtia, spesifisiä kodoneja, neljä emäskodonia ei-luonnollisille aminohapoille.

Transposonipohjainen satunnainen mutageneesi

Viime aikoina on raportoitu monia menetelmiä transposonipohjaiseen satunnaiseen mutageneesiin. Näitä menetelmiä ovat muun muassa seuraavat: PERMUTE-satunnainen pyöreä permutaatio, satunnainen proteiinin katkaisu, satunnainen nukleotiditriplettisubstituutio, satunnainen domeeni / tunniste / useiden aminohappojen insertti, kodoniskannausmutageneesi ja multikodoniskannausmutageneesi. Nämä kaikki edellä mainitut tekniikat edellyttävät mini-Mu-transposonien suunnittelua. Thermo Scientific valmistaa sarjoja näiden transposonien suunnittelua varten.

Satunnaiset mutageneesimenetelmät, jotka muuttavat kohde-DNA: n pituutta

Näihin menetelmiin sisältyy geenipituuden muuttaminen insertio- ja deleetiomutaatioiden avulla. Esimerkki on tandem-toistosyöttö (TRINS) -menetelmä. Tämä tekniikka johtaa kohdegeenin satunnaisten fragmenttien tandem-toistojen muodostumiseen vieritysympyrämonistuksella ja näiden toistojen samanaikaisella liittämisellä kohdegeeniin.

Mutaattorikannat

Mutaattorikannat ovat bakteerisolulinjoja, joista puuttuu yksi tai useampi DNA: n korjausmekanismi. Esimerkki mutaattorisäikeestä on E. coli XL1-RED. Tämä E. colin alempi kanta on puutteellinen MutS-, MutD- ja MutT-DNA-korjausreiteissä. Mutaattorikantojen käyttö on hyödyllistä monenlaisten mutaatioiden tuomisessa; nämä kannat osoittavat kuitenkin etenevää viljelysairautta johtuen mutaatioiden kasautumisesta kannan omaan genomiin.

Kohdennettu mutageneesi

Kohdennetut mutageeniset menetelmät tuottavat mutaatioita ennalta määrätyissä aminohappotähteissä. Nämä tekniikat edellyttävät kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin sekvenssi-funktion suhteen ymmärtämistä. Tämän suhteen ymmärtäminen mahdollistaa tähteiden tunnistamisen, jotka ovat tärkeitä stabiilisuudessa, stereoselektiivisyydessä ja katalyyttisessä tehokkuudessa. Alla on esimerkkejä menetelmistä, jotka tuottavat kohdennettua mutageneesiä.

Sivuston saturaation mutageneesi

Kohdekyllästysmutageneesi on PCR-pohjainen menetelmä, jota käytetään kohdentamaan aminohapot, joilla on merkittävä rooli proteiinin toiminnassa. Kaksi yleisintä tekniikkaa tämän suorittamiseksi ovat koko plasmidi-yksittäinen PCR ja päällekkäinen jatke-PCR.

Koko plasmidin yksittäiseen PCR: ään viitataan myös nimellä kohdennettu mutageneesi (SDM). SDM-tuotteille suoritetaan Dpn-endonukleaasihajotus. Tämä pilkkominen johtaa vain vanhemman juosteen pilkkomiseen, koska vanhemman juoste sisältää GmATC: n, joka metyloidaan adeniinin N6: ssa. SDM ei toimi hyvin suurille plasmideille, joiden kanta on yli kymmenen kiloa. Tämä menetelmä pystyy myös korvaamaan vain kaksi nukleotidia kerrallaan.

Päällekkäinen jatke-PCR edellyttää kahden alukeparin käyttöä. Yksi aluke kussakin sarjassa sisältää mutaation. Suoritetaan ensimmäinen PCR-kierros näitä alukesarjoja käyttäen ja muodostetaan kaksi kaksisäikeistä DNA-dupleksia. Sitten suoritetaan toinen PCR-kierros, jossa nämä dupleksit denaturoidaan ja hehkutetaan alukesarjoilla uudelleen heteroduplexien tuottamiseksi, joissa jokaisella juosteella on mutaatio. Mahdolliset aukot näissä vasta muodostuneissa heteroduplexeissa täytetään DNA-polymeraaseilla ja monistetaan edelleen.

Sekvenssikyllästysmutageneesi (SeSaM)

Sekvenssikyllästysmutageneesi johtaa kohdesekvenssin satunnaistamiseen jokaisessa nukleotidiasemassa. Tämä menetelmä alkaa vaihtelevan pituisten DNA-fragmenttien tuottamisesta, jotka on pyrstöity universaaleilla emäksillä käyttämällä templaattitransferaaseja 3'-päissä. Seuraavaksi nämä fragmentit pidennetään täyspitkiksi käyttämällä yksijuosteista mallia. Universaalit emäkset korvataan satunnaisella standardipohjalla, aiheuttaen mutaatioita. Tätä menetelmää on useita muokattuja versioita, kuten SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv + ja SeSAM-III.

Yhden alukkeen reaktiot rinnakkain (SPRINP)

Tähän kohtaan kyllästysmutageneesimenetelmään sisältyy kaksi erillistä PCR-reaktiota. Ensimmäisessä niistä käytetään vain eteenpäin suuntautuvia alukkeita, kun taas toisessa reaktiossa käytetään vain käänteisiä alukkeita. Tämä välttää alukedimeerin muodostumisen.

Megapohjustettu ja ligaaasiton keskittynyt mutageneesi

Tämä sivuston kyllästysmutageeninen tekniikka alkaa yhdellä mutageenisella oligonukleotidilla ja yhdellä universaalilla reunusalukkeella. Näitä kahta reagenssia käytetään PCR-alkusyklissä. Tämän ensimmäisen PCR-syklin tuotteita käytetään mega-alukkeina seuraavaa PCR: ää varten.

Ω-PCR

Tämä sivuston kyllästysmutageeninen menetelmä perustuu päällekkäiseen jatke-PCR: ään. Sitä käytetään mutaatioiden tuomiseen mihin tahansa kohtaan pyöreässä plasmidissa.

PFunkel-ominchange-OSCARR

Tämä menetelmä käyttää käyttäjän määrittelemää kohdennettua mutageneesiä yhdessä tai useammassa paikassa samanaikaisesti. OSCARR on lyhenne yhdestä potin yksinkertaisesta menetelmästä kasettien satunnaistamiseen ja rekombinaatioon . Tämä satunnaistaminen ja rekombinaatio johtaa toivottujen proteiinifragmenttien satunnaistamiseen. Omnichange on sekvenssistä riippumaton, monisivustoinen saturaatiomutageneesi, joka voi kyllästää jopa viisi riippumatonta kodonia geenissä.

Trimeeri-dimeeri-mutageneesi

Tämä menetelmä poistaa redundantit kodonit ja lopetuskodonit.

Kasetin mutageneesi

Tämä on PCR-pohjainen menetelmä. Kasetin mutageneesi alkaa kiinnostavan geenin sisältävän DNA-kasetin synteesillä, jota reunustavat kummallakin puolella restriktiokohdat. Endonukleaasi, joka katkaisee nämä restriktiokohdat, katkaisee myös kohdeplasmidissa olevat kohdat. Sekä DNA-kasettia että kohdeplasmidia käsitellään endonukleaaseilla näiden restriktiokohtien katkaisemiseksi ja tahmeajen päiden muodostamiseksi. Seuraavaksi tämän pilkkomisen tuotteet ligoidaan yhteen, mikä johtaa geenin insertioon kohdeplasmidiin. Vaihtoehtoista kasettimutageneesin muotoa, jota kutsutaan yhdistelmäkasettimutageneesiksi, käytetään tunnistamaan yksittäisten aminohappotähteiden toiminnot kiinnostavassa proteiinissa. Rekursiivinen yhtymämutageneesi hyödyntää sitten tietoa aikaisemmasta yhdistelmäkasettimutageneesistä. Codon-kasettimutageneesin avulla voit lisätä tai korvata yhden kodonin tietyssä kohdassa kaksisäikeisessä DNA: ssa.

Seksuaaliset menetelmät

Suunnatun evoluution seksuaalisiin menetelmiin sisältyy in vitro -rekombinaatio, joka jäljittelee luonnollista in vivo -rekombinaatiota. Yleensä nämä tekniikat edellyttävät suurta sekvenssihomologiaa vanhempien sekvenssien välillä. Näitä tekniikoita käytetään usein yhdistämään kaksi erilaista vanhempaingeeniä, ja nämä menetelmät luovat ristiinvientiä näiden geenien välillä.

In vitro homologinen rekombinaatio

Homologinen rekombinaatio voidaan luokitella joko in vivo tai in vitro. In vitro homologinen rekombinaatio jäljittelee luonnollista rekombinaatiota in vivo . Nämä in vitro -rekombinaatiomenetelmät edellyttävät suurta sekvenssihomologiaa vanhempien sekvenssien välillä. Nämä tekniikat hyödyntävät vanhempaingeenien luonnollista monimuotoisuutta yhdistämällä ne kimeeristen geenien tuottamiseksi. Tuloksena olevalla kimeeralla on sekoitus vanhempien ominaisuuksia.

DNA: n sekoittaminen

Tämä in vitro -tekniikka oli yksi ensimmäisistä tekniikoista rekombinaation aikakaudella. Se alkaa homologisten vanhempaingeenien pilkkomisesta pieniksi fragmenteiksi DNaasi1: n toimesta. Nämä pienet fragmentit puhdistetaan sitten emättämättömistä vanhempaingeeneistä. Puhdistetut fragmentit kootaan sitten uudelleen käyttäen aluketta sisältämätöntä PCR: ää. Tämä PCR sisältää homologisia fragmentteja erilaisista vanhempaingeeneistä, jotka ovat alukkeita toisilleen, jolloin saadaan kimeerinen DNA. Vanhempainkokoinen kimeerinen DNA monistetaan sitten käyttämällä päätepääalukkeita tavallisessa PCR: ssä.

Satunnainen alustus in vitro -rekombinaatio (RPR)

Tämä in vitro homologinen rekombinaatiomenetelmä alkaa syntetisoimalla monia lyhyitä geenifragmentteja, jotka osoittavat pistemutaatioita käyttämällä satunnaisjärjestysalukkeita. Nämä fragmentit kootaan uudelleen täyspitkiksi vanhempaingeeneiksi käyttäen aluketta sisältämätöntä PCR: ää. Nämä uudelleen kootut sekvenssit monistetaan sitten PCR: llä ja alistetaan uusille valintaprosesseille. Tämä menetelmä on edullinen suhteessa DNA: n sekoittamiseen, koska DNaasi1: tä ei käytetä, joten pyrimidiininukleotidin vieressä ei ole rekombinaation puolueellisuutta. Tämä menetelmä on edullinen myös sen vuoksi, että siinä käytetään synteettisiä satunnaisia ​​alukkeita, joiden pituus on tasainen ja joilla ei ole ennakkoluuloja. Lopuksi tämä menetelmä on riippumaton DNA-templaattisekvenssin pituudesta ja vaatii pienen määrän vanhempien DNA: ta.

Katkaistu metagenominen geenispesifinen PCR

Tämä menetelmä tuottaa kimeerisiä geenejä suoraan metagenomisista näytteistä. Se alkaa halutun geenin eristämisestä toiminnallisella seulonnalla metagenomisesta DNA-näytteestä. Seuraavaksi suunnitellaan ja käytetään spesifisiä alukkeita homologisten geenien monistamiseksi erilaisista ympäristönäytteistä. Lopuksi muodostetaan kimeeriset kirjastot haluttujen funktionaalisten kloonien noutamiseksi sekoittamalla nämä monistetut homologiset geenit.

Porrastettu laajennusprosessi (STEP)

Tämä in vitro -menetelmä perustuu templaattikytkentään kimeeristen geenien tuottamiseksi. Tämä PCR-pohjainen menetelmä alkaa templaatin alkuperäisellä denaturoinnilla, jota seuraa alukkeiden hehkutus ja lyhyt jatkoaika. Kaikki seuraavat jaksot muodostavat pariutumisen edellisissä sykleissä syntyneiden lyhyiden fragmenttien ja mallin eri osien välille. Nämä lyhyet fragmentit ja templaatit hehkuvat yhdessä sekvenssikomplementaarisuuden perusteella. Tämä fragmentti-DNA: n hehkuttavien fragmenttien prosessi tunnetaan templaatin vaihtamisena. Nämä hehkutetut fragmentit toimivat sitten alukkeina jatkamiselle. Tätä menetelmää suoritetaan, kunnes saadaan kimeerinen geenisekvenssi vanhempien pituudesta. Tämän menetelmän suorittaminen vaatii vain reunusalukkeiden aloittamisen. Dnase1-entsyymiä ei myöskään tarvita.

Satunnainen kime- geneneesi ohimenevissä malleissa (RACHITT)

Tämän menetelmän on osoitettu tuottavan kimeerisiä geenikirjastoja, joissa on keskimäärin 14 ristikkäistä kimeeristä geeniä kohden. Se alkaa kohdistamalla fragmentit vanhemman yläsäikeestä urasiilia sisältävän templaatin alempaan juosteeseen homologisesta geenistä. 5'- ja 3'-ulkonevat läpät katkaistaan ​​ja aukot täytetään Pfu- ja taq-DNA-polymeraasien eksonukleaasi- ja endonukleaasiaktiivisuuksilla. Urasiilia sisältävä templaatti poistetaan sitten heteroduplexista käsittelemällä urasiilin DNA-glykosylaasilla, mitä seuraa monistaminen edelleen PCR: ää käyttäen. Tämä menetelmä on edullinen, koska se tuottaa kimeerejä, joilla on suhteellisen korkea jakotaajuus. Se on kuitenkin jonkin verran rajoitettu yksisäikeisen DNA: n ja yksijuosteisen templaatti-DNA: n muodostamisen monimutkaisuuden ja tarpeen vuoksi.

Synteettinen sekoitus

Synteettisten rappeutuneiden oligonukleotidien sekoittaminen lisää joustavuutta sekoitusmenetelmiin, koska optimaalisia kodoneja ja hyödyllisiä mutaatioita sisältävät oligonukleotidit voidaan sisällyttää.

In vivo homologinen rekombinaatio

Hiivassa suoritettu kloonaus käsittää fragmentoitujen ilmentämisvektoreiden PCR-riippuvaisen uudelleen kokoamisen. Nämä uudelleen kootut vektorit tuodaan sitten hiivaan ja kloonataan siihen. Hiivan käyttö vektorin kloonaamiseksi välttää toksisuuden ja vastavalinnan, joka johtaisi ligaatiolla ja etenemisellä E. coliin.

Mutageenisesti organisoitu rekombinaatioprosessi homologisella in vivo -ryhmittelyllä (MORPHING)

Tämä menetelmä tuo mutaatiot geenien spesifisille alueille ja jättää muut osat ehjiksi hyödyntämällä homologisen rekombinaation suurta taajuutta hiivassa.

Faagiavusteinen jatkuva evoluutio (PACE)

Tässä menetelmässä käytetään bakteriofagia, jolla on modifioitu elinkaari, kehittyvien geenien siirtämiseksi isännästä isäntään. Faagin elinkaari on suunniteltu siten, että siirto korreloi entsyymin kiinnostavan aktiivisuuden kanssa. Tämä menetelmä on edullinen, koska se vaatii ihmisen minimaalista puuttumista geenin jatkuvaan evoluutioon.

In vitro ei-homologiset rekombinaatiomenetelmät

Nämä menetelmät perustuvat siihen tosiasiaan, että proteiineilla voi olla samanlainen rakenteellinen identiteetti ilman sekvenssihomologiaa.

Exonin sekoitus

Eksonin sekoittaminen on eri proteiinien eksonien yhdistelmä introneissa tapahtuvien rekombinaatiotapahtumien avulla. Ortologisen eksonin sekoittaminen tarkoittaa eri lajien ortologisten geenien eksonien yhdistämistä. Ortologisen domeenin sekoittaminen sisältää kokonaisten proteiinidomeenien sekoittamisen eri lajien ortologisista geeneistä. Paraloginen eksonin sekoittaminen tarkoittaa eksonin sekoittamista saman lajin eri geeneistä. Paralogisen domeenin sekoittaminen tarkoittaa kokonaisten proteiinidomeenien sekoittamista saman lajin paralogisista proteiineista. Toiminnallinen homologin sekoitus sisältää ei-homologisten domeenien sekoittamisen, jotka liittyvät toiminnallisesti. Kaikilla näillä prosesseilla on monistettu halutut eksonit eri geeneistä käyttämällä kimeerisiä synteettisiä oligonukleotideja. Nämä monistustuotteet kootaan sitten uudelleen täyspitkiksi geeneiksi käyttäen aluketta sisältämätöntä PCR: ää. Näiden PCR-syklien aikana fragmentit toimivat templaateina ja alukkeina. Tämä johtaa kimeerisiin täyspitkiin geeneihin, jotka sitten seulotaan.

Inkrementaalinen katkaisu hybridientsyymien luomiseksi (ITCHY)

Vanhempien geenien fragmentit luodaan käyttämällä kontrolloitua pilkkomista eksonukleaasi III: lla. Nämä fragmentit tylsistetään käyttämällä endonukleaasia, ja ne ligoidaan hybridigeenien tuottamiseksi. TIOITCHY on modifioitu ITCHY-tekniikka, joka käytti nukleotiditrifosfaatti-analogeja, kuten a-fosfotioaatti-dNTP: itä. Näiden nukleotidien sisällyttäminen estää eksonukleaasi III: n pilkkomisen. Tätä eksonukleaasi III: n aiheuttamaa ruoansulatuksen estämistä kutsutaan piikiksi. Piikki voidaan saavuttaa katkaisemalla ensin geenit eksonukleaasilla fragmenttien luomiseksi lyhyillä yksisäikeisillä ulkonemilla. Nämä fragmentit toimivat sitten templaateina monistamiseksi DNA-polymeraasilla pienien määrien fosfotioaatti-dNTP: iden läsnä ollessa. Nämä saadut fragmentit ligoidaan sitten yhteen täyspitkien geenien muodostamiseksi. Vaihtoehtoisesti ehjät vanhempaingeenit voidaan monistaa PCR: llä normaalien dNTP: iden ja fosfotioaatti-dNTP: iden läsnä ollessa. Nämä täyspitkät monistustuotteet pilkotaan sitten eksonukleaasilla. Ruoansulatus jatkuu, kunnes eksonukleaasi kohtaa a-pdNTP: n, mikä johtaa eripituisiin fragmentteihin. Nämä fragmentit ligoidaan sitten yhteen kimeeristen geenien muodostamiseksi.

RAHISEVA

Tämä menetelmä tuottaa kirjastoja hybridigeeneistä, jotka estävät useita ristikkäisiä yhdistämällä DNA: n sekoittamisen ja ITCHY: n. Tämä menetelmä alkaa kahden itsenäisen ITCHY-kirjaston rakentamisesta. Ensimmäisessä geeni A on N-päässä. Ja toisella, jolla on geeni B N-päässä. Nämä hybridigeenifragmentit erotetaan joko restriktioentsyymidigestiolla tai PCR: llä pääte-alukkeilla agaroosigeelielektroforeesilla. Nämä eristetyt fragmentit sekoitetaan sitten yhteen ja pilkotaan edelleen DNaasilla 1. Sitten pilkotut fragmentit kootaan uudelleen alukkeettomalla PCR: llä mallinvaihdolla.

Yhdistetty laajennus katkaistuissa malleissa (RETT)

Tämä menetelmä tuottaa hybridigeenikirjastoja vaihtamalla templaatti yksisuuntaisesti kasvavia polynukleotideja yksijuosteisten DNA-fragmenttien läsnä ollessa kimeerien templaateina. Tämä menetelmä alkaa yksisäikeisten DNA-fragmenttien valmistuksella käänteiskopioimalla kohde-mRNA: sta. Geenispesifiset alukkeet hehkutetaan sitten yksijuosteiseen DNA: han. Näitä geenejä laajennetaan sitten PCR-syklin aikana. Tätä sykliä seuraa templaattikytkentä ja hehkutus aikaisemmasta alukepidennyksestä saaduista lyhyistä fragmenteista muihin yksijuosteisiin DNA-fragmentteihin. Tätä prosessia toistetaan, kunnes saadaan täyspitkä yksisäikeinen DNA.

Sekvenssihomologiasta riippumaton proteiinin rekombinaatio (SHIPREC)

Tämä menetelmä tuottaa rekombinaation sellaisten geenien välillä, joilla on vähän tai ei lainkaan sekvenssihomologiaa. Nämä kimeerit fuusioidaan linkkerisekvenssin kautta, joka sisältää useita restriktiokohtia. Tämä rakenne pilkotaan sitten DNase1: llä. Fragmentit valmistetaan tylpiksi käyttämällä S1-nukleaasia. Nämä tylpät fragmentit kootaan yhteen pyöreään sekvenssiin ligaatiolla. Tämä pyöreä rakenne linearisoidaan sitten käyttämällä restriktioentsyymejä, joiden restriktiokohtia on linkkerialueella. Tämä johtaa kimeeristen geenien kirjastoon, jossa geenien osuus 5'- ja 3'-päissä kääntyy päinvastaiseksi verrattuna lähtörakenteeseen.

Sekvenssistä riippumaton, kohdennettu kimeereneesi (SISDC)

Tämä menetelmä johtaa geenikirjastoon, jossa on useita ristikkäisiä useista vanhempaingeeneistä. Tämä menetelmä ei vaadi sekvenssiidentiteettiä vanhempaingeenien välillä. Tämä vaatii yhden tai kaksi konservoitunutta aminohappoa jokaisessa crossover-asennossa. Se alkaa vanhempien sekvenssien kohdentamisella ja konsensus-alueiden tunnistamisella, jotka toimivat jakosivustoina. Tätä seuraa spesifisten leimojen sisällyttäminen, jotka sisältävät restriktiokohtia, minkä jälkeen leimat poistetaan pilkkomalla Bac1: llä, jolloin saadaan geenit, joilla on yhtenäiset päät. Nämä geenifragmentit sekoitetaan ja ligoidaan sopivassa järjestyksessä kimeeristen kirjastojen muodostamiseksi.

Degeneroitunut homoduplex-rekombinaatio (DHR)

Tämä menetelmä alkaa homologisten geenien kohdentamisella, jota seuraa polymorfismin alueiden tunnistaminen. Seuraavaksi geenin yläjuoste jaetaan pieniksi rappeutuneiksi oligonukleotideiksi. Pohjanauha pilkotaan myös oligonukleotideiksi toimiakseen telineinä. Nämä fragmentit yhdistetään liuoksessa, kun yläjuosteiset oligonukleotidit on koottu pohjajuosteisiin oligonukleotideihin. Näiden fragmenttien väliset aukot täytetään polymeraasilla ja ligoidaan.

Satunnainen monirekombinantti PCR (RM-PCR)

Tämä menetelmä käsittää useiden DNA-fragmenttien sekoittamisen ilman homologiaa yhdessä PCR: ssä. Tämä johtaa täydellisten proteiinien rekonstruointiin kokoamalla moduuleja, jotka koodaavat eri rakenneyksiköitä.

Käyttäjäystävällinen DNA-rekombinaatio (USERec)

Tämä menetelmä alkaa geenifragmenttien monistamisesta, jotka on yhdistettävä uudelleen käyttämällä urasiilin dNTP: itä. Tämä monistusliuos sisältää myös alukkeita, PfuTurbo ja Cx Hotstart DNA-polymeraasia. Monistettuja tuotteita inkuboidaan seuraavaksi USER-entsyymin kanssa. Tämä entsyymi katalysoi urasiilijäämien poistamisen DNA: sta, mikä luo yhden emäsparin aukkoja. USER-entsyymillä käsitellyt fragmentit sekoitetaan ja ligoidaan T4-DNA-ligaasia käyttäen ja alistetaan Dpn1-pilkkomiseen templaatti-DNA: n poistamiseksi. Nämä syntyneet dingle-säikeiset fragmentit monistetaan PCR: ää käyttäen ja transformoidaan E. coliin.

Golden Gate shuffling (GGS) -rekombinaatio

Tämä menetelmä antaa sinun yhdistää vähintään 9 erilaista fragmenttia akseptorivektoriin käyttämällä tyypin 2 restriktioentsyymiä, joka leikkaa restriktiokohtien ulkopuolella. Se alkaa fragmenttien alakloonauksella erillisiin vektoreihin Bsa1-reunustavien sekvenssien luomiseksi molemmille puolille. Nämä vektorit pilkotaan sitten käyttämällä tyypin II restriktioentsyymiä Bsa1, joka muodostaa neljä nukleotidia, yksijuosteista uloketta. Fragmentit, joilla on komplementaariset ulkonemat, hybridisoidaan ja ligoidaan käyttäen T4-DNA-ligaasia. Lopuksi nämä rakenteet transformoidaan sitten E. coli -soluihin, jotka seulotaan ekspressiotasojen suhteen.

Fosforitioaattipohjainen DNA-rekombinaatiomenetelmä (PRTec)

Tätä menetelmää voidaan käyttää yhdistelemään rakenneelementtejä tai kokonaisia ​​proteiinidomeeneja. Tämä menetelmä perustuu fosforotioaattikemiaan, joka sallii fosforotiodiesterisidosten spesifisen pilkkomisen. Prosessin ensimmäinen vaihe alkaa fragmenttien monistamisella, jotka on yhdistettävä uudelleen vektorirungon kanssa. Tämä monistus suoritetaan käyttämällä alukkeita, joiden 5'-päässä on fosforotioloituja nukleotideja. Monistetut PCR-tuotteet pilkotaan etanoli-jodiliuoksessa korkeissa lämpötiloissa. Seuraavaksi nämä fragmentit hybridisoidaan huoneenlämpötilassa ja transformoidaan E. coliksi, joka korjaa kaikki kolkut.

Integron

Tämä järjestelmä perustuu luonnolliseen paikkaspesifiseen rekombinaatiojärjestelmään E. colissa. Tätä järjestelmää kutsutaan integronijärjestelmäksi, ja se tuottaa luonnollista geenien sekoittamista. Tätä menetelmää käytettiin funktionaalisen tryptofaanibiosynteettisen operonin rakentamiseen ja optimointiin trp-puutteellisissa E. colissa toimittamalla yksittäisiä rekombinaatiokasetteja tai trpA-E-geenejä yhdessä säätelyelementtien kanssa integronijärjestelmän kanssa.

Y-Ligation-pohjainen sekoitus (YLBS)

Tämä menetelmä tuottaa yksisäikeisiä DNA-juosteita, jotka käsittävät yhden lohkosekvenssin joko 5'- tai 3'-päässä, komplementaariset sekvenssit varren silmukan alueella ja D-haara-alueen, joka toimii alukkeen sitoutumiskohtana PCR: lle. Ekvivalentit määrät sekä 5'- että 3'-puolisäikeitä sekoitetaan ja muodostavat hybridin varren alueen komplementaarisuuden vuoksi. Hybridit, joissa on vapaita fosforyloituja 5'-päitä 3'-puolisäikeissä, ligoidaan sitten vapaiden 3'-päiden kanssa 5'-puolisäikeisiin käyttämällä T4-DNA-ligaasia 0,1 mM ATP: n läsnä ollessa. Sitoutuneet tuotteet monistetaan sitten kahden tyyppisellä PCR: llä, jotta saadaan 5'-puolikas ja ennen 3'-puoli-PCR-tuotteita. Nämä PCR-tuotteet muunnetaan yksittäisiksi juosteiksi avidiini-biotiinia sitomalla primaarien 5'-päähän, jotka sisältävät biotiinileimattuja kantasekvenssejä. Seuraavaksi käytetään biotinyloituja 5'-puolisäikeitä ja ei-biotinyloituja 3'-puolisäikeitä 5'- ja 3'-puolisäikeinä seuraavassa Y-ligaatiosyklissä.

Puolirationaalinen muotoilu

Puolirationaalinen suunnittelu käyttää tietoa proteiinisekvenssistä, rakenteesta ja toiminnasta yhdessä ennustavien algoritmien kanssa. Näitä yhdessä käytetään tunnistamaan kohdeaminohappotähteet, jotka todennäköisimmin vaikuttavat proteiinin toimintaan. Näiden keskeisten aminohappotähteiden mutaatiot luovat mutanttiproteiinien kirjastoja, joilla on todennäköisemmin parannettuja ominaisuuksia.

Puolirationaalisen entsyymitekniikan ja de novo -entsyymisuunnittelun kehitys tarjoaa tutkijoille tehokkaita ja tehokkaita uusia strategioita biokatalyyttien manipuloimiseksi. Sekvenssi- ja rakennepohjaisten lähestymistapojen integrointi kirjaston suunnittelussa on osoittautunut erinomaiseksi oppaaksi entsyymien uudelleensuunnittelussa. Yleensä nykyiset laskennalliset de novo- ja uudelleensuunnittelumenetelmät eivät vertaa katalyyttisen suorituskyvyn kehittyneisiin muunnoksiin. Vaikka kokeellista optimointia voidaan tuottaa suunnattua evoluutiota käyttäen, parannuksia rakenneennusteiden tarkkuuteen ja suurempaan katalyyttiseen kykyyn saavutetaan parantamalla suunnittelualgoritmeja. Muita toiminnallisia parannuksia voidaan sisällyttää tuleviin simulaatioihin integroimalla proteiinidynamiikka.

Biokemialliset ja biofysikaaliset tutkimukset sekä ennustavien kehysten hienosäätö ovat hyödyllisiä arvioitaessa kokeellisesti yksittäisten suunnitteluominaisuuksien toiminnallista merkitystä. Näiden toiminnallisten panosten parempi ymmärtäminen antaa palautetta tulevien mallien parantamiseksi.

Suunnattua evoluutiota ei todennäköisesti korvata valintamenetelmänä proteiinitekniikassa, vaikka laskennallinen proteiinisuunnittelu on muuttanut perusteellisesti tapaa, jolla proteiinitekniikka voi manipuloida biomakromolekyylejä. Pienempiä, tarkempia ja toiminnallisesti rikkaita kirjastoja voidaan luoda käyttämällä menetelmissä, jotka sisältävät ennustavia kehyksiä hypoteesipohjaiseen proteiinitekniikkaan. Uudet suunnittelustrategiat ja tekninen kehitys ovat alkaneet poiketa perinteisistä protokollista, kuten suunnatusta evoluutiosta, joka on tehokkain strategia parhaiten menestyvien ehdokkaiden tunnistamiseksi kohdennetuissa kirjastoissa. Koko geenikirjastosynteesi korvaa sekoitus- ja mutageneesiprotokollat ​​kirjaston valmistelussa. Myös erittäin spesifisiä pienitehoisia seulontamäärityksiä käytetään yhä useammin miljoonien ehdokkaiden monumentaalisen seulonnan ja valintatoimien sijaan. Yhdessä nämä kehityssuunnat ovat valmiita siirtämään proteiinitekniikka ohjatun evoluution ulkopuolelle ja kohti käytännöllisiä, tehokkaampia strategioita biokatalyyttien räätälöimiseksi.

Seulonta- ja valintatekniikat

Kun proteiini on läpikäynyt suunnatun evoluution, annosmuodostuksen tai puoliannoksen suunnittelun, mutanttiproteiinien kirjastot on seulottava sen määrittämiseksi, mitkä mutantit osoittavat parannettuja ominaisuuksia. Faagin näyttömenetelmät ovat yksi vaihtoehto proteiinien seulonnassa. Tämä menetelmä sisältää polypeptidimuunnoksia koodaavien geenien fuusion faagikerrosproteiinigeenien kanssa. Faagipinnoilla ilmentyvät proteiinivariantit valitaan sitoutumalla immobilisoituihin kohteisiin in vitro. Faagit, joissa on valikoituja proteiinivariantteja, monistetaan sitten bakteereissa, minkä jälkeen positiiviset kloonit tunnistetaan entsyymiin liittyvällä immunosorbenttimäärityksellä. Nämä valitut faagit altistetaan sitten DNA-sekvensoinnille.

Solupinnan näyttöjärjestelmiä voidaan käyttää myös mutanttien polypeptidikirjastojen seulontaan. Kirjastomutanttigeenit sisällytetään ekspressiovektoreihin, jotka sitten transformoidaan sopiviksi isäntäsoluiksi. Nämä isäntäsolut altistetaan edelleen suuritehoisille seulontamenetelmille solujen tunnistamiseksi halutulla fenotyypillä.

Soluvapaa näyttöjärjestelmä on kehitetty hyödyntämään in vitro -proteiini- tai -solutranslaatiota. Näitä menetelmiä ovat mRNA-näyttö, ribosominäyttö, kovalenttinen ja ei-kovalenttinen DNA-näyttö ja in vitro -osastointi.

Entsyymitekniikka

Entsyymitekniikka on entsyymin rakenteen (ja siten myös sen toiminnan) tai eristettyjen entsyymien katalyyttisen aktiivisuuden modifiointi uusien metaboliittien tuottamiseksi, uusien (katalysoitujen) reaktioreittien sallimiseksi tai muuntamiseksi joistakin tietyistä yhdisteistä muiksi ( biotransformaatio ). Nämä tuotteet ovat hyödyllisiä kemikaaleina, lääkkeinä, polttoaineina, elintarvikkeina tai maatalouden lisäaineina.

Entsyymi reaktori koostuu astian, joka sisältää reaktionaalinen väliainetta, jota käytetään suorittamaan haluttu konversio entsymaattisesti. Tässä prosessissa käytetyt entsyymit ovat liuoksessa vapaita.

Esimerkkejä muokatuista proteiineista

Laskentamenetelmiä on käytetty suunnittelemaan proteiini uudella taitoksella, nimeltään Top7 , ja anturit luonnottomille molekyyleille. Fuusioproteiinien suunnittelu on tuottanut rilonaseptin , lääkkeen, joka on saanut Food and Drug Administrationin (FDA) hyväksynnän kryopyriiniin liittyvän jaksollisen oireyhtymän hoidossa .

Toinen laskentamenetelmä, IPRO, onnistui muokkaamaan Candida boidinii-ksyloosireduktaasin kofaktorispesifisyyden vaihtamista. Iteratiivinen proteiinien uudelleensuunnittelu ja optimointi (IPRO) suunnittelee proteiinit uudelleen natiivien tai uusien substraattien ja kofaktorien lisäämiseksi tai spesifisyyden lisäämiseksi . Tämä tapahtuu toistuvasti satunnaisesti häiritsemällä proteiinien rakennetta määriteltyjen suunnitteluasemien ympärillä, tunnistamalla rotameerien pienin energiayhdistelmä ja määrittämällä, onko uudella rakenteella pienempi sitoutumisenergia kuin aikaisemmilla.

Laskennallisella suunnittelulla on myös suunniteltu erittäin tilatun nano-proteiinikokoonpanon monimutkaisia ​​ominaisuuksia. Proteiinihäkki, E. coli bakterioferritiini (EcBfr), jolla on luonnollisesti rakenteellinen epävakaus ja epätäydellinen itsekokoonpanokäyttäytyminen täyttämällä kaksi oligomerointitilaa, on malliproteiini tässä tutkimuksessa. Laskennallisen analyysin ja vertailun homologeihinsa avulla on havaittu, että tällä proteiinilla on keskimääräistä pienempi dimeerinen rajapinta sen kaksinkertaisessa symmetria-akselissa johtuen lähinnä kahden vesisilloitetun asparagiinijäännöksen keskitetystä rajapintavedestä. . EcBfr: n suunnittelun mahdollisuuden tutkimiseksi modifioidusta rakenteellisesta stabiilisuudesta käytetään puoliempiiristä laskennallista menetelmää virtuaalisesti tutkia 480 mahdollisen mutantin energiaerot dimeerisellä rajapinnalla suhteessa villityypin EcBfr: ään. Tämä laskennallinen tutkimus yhtyy myös vesisilloitettuihin asparagiiniin . Näiden kahden asparagiinin korvaaminen hydrofobisilla aminohapoilla johtaa proteiineihin, jotka taittuvat alfa-kierteisiksi monomeereiksi ja kokoontuvat häkkeihin, kuten pyöreä dikroismi ja transmissioelektronimikroskopia osoittavat. Sekä terminen että kemiallinen denaturaatio vahvistavat, että kaikilla uudelleen suunnitelluilla proteiineilla on lisääntynyt vakaus laskelmien mukaisesti. Yksi kolmesta mutaatiosta siirtää populaation korkeamman asteen oligomerointitilan hyväksi liuoksessa, kuten sekä kokoekskluusiokromatografia että natiivi geelielektroforeesi osoittavat.

In silico menetelmä, PoreDesigner, on menestyksekkäästi kehitetty muokattava bakteerien kanavan proteiini (OmpF) vähentää sen 1 nm: n huokoskoon mihin tahansa haluttuun ala-nm ulottuvuus. Kuljetuskokeet kapeimmilla suunnitelluilla huokosilla paljastivat täydellisen suolan hylkäämisen, kun ne koottiin biomimeettisiin lohko-polymeerimatriiseihin.

Katso myös

Viitteet

Ulkoiset linkit

• palvelimet proteiinitekniikkaan ja siihen liittyviin aiheisiin WHAT IF -ohjelmiston perusteella
• Entsyymit rakennettu naarmuilta - Tutkijat suunnittelevat ennennäkemättömät katalyytit uudella laskentatekniikalla, Technology Review , 10. maaliskuuta 2008