Protein engineering - Protein engineering

Protein engineering er processen med at udvikle nyttige eller værdifulde proteiner . Det er en ung disciplin, hvor meget forskning finder sted i forståelsen af proteinfoldning og anerkendelse af proteindesignprincipper . Det er også et produkt- og servicemarked med en anslået værdi på $ 168 mia. I 2017.

Der er to generelle strategier til proteinteknik: rationelt proteindesign og styret evolution . Disse metoder udelukker ikke hinanden; forskere vil ofte anvende begge dele. I fremtiden kan mere detaljeret viden om proteinstruktur og funktion og fremskridt inden for screening med høj kapacitet muligvis udvide proteinteknikens evner. Til sidst kan selv unaturlige aminosyrer inkluderes via nyere metoder, såsom udvidet genetisk kode , der tillader kodning af nye aminosyrer i genetisk kode.

Tilgange

Rationelt design

I rationelt proteindesign bruger en videnskabsmand detaljeret viden om et proteins struktur og funktion til at foretage de ønskede ændringer. Generelt har dette fordelen ved at være billig og teknisk let, da stedstyrede mutagenesemetoder er veludviklede. Imidlertid er dens største ulempe, at detaljeret strukturel viden om et protein ofte ikke er tilgængelig, og selv når det er tilgængeligt, kan det være meget vanskeligt at forudsige virkningerne af forskellige mutationer, da strukturel information oftest giver et statisk billede af en proteinstruktur. Imidlertid har programmer som Folding @ home og Foldit brugt Crowdsourcing- teknikker for at få indsigt i proteins foldemotiver.

Computational protein design algoritmer søger at identificere nye aminosyresekvenser, der har lav energi, når de foldes til den forud specificerede målstruktur. Mens det sekvenskonformationsrum, der skal søges, er stort, er det mest udfordrende krav til beregningsproteindesign en hurtig, men alligevel nøjagtig energifunktion, der kan skelne mellem optimale sekvenser og lignende suboptimale.

Flere sekvensjustering

Uden strukturel information om et protein er sekvensanalyse ofte nyttig til at belyse information om proteinet. Disse teknikker involverer justering af målproteinsekvenser med andre relaterede proteinsekvenser. Denne tilpasning kan vise, hvilke aminosyrer der er konserveret mellem arter og er vigtige for proteinets funktion. Disse analyser kan hjælpe med at identificere hot spot aminosyrer, der kan tjene som målsteder for mutationer. Multipel sekvensjustering anvender databaser såsom PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE og BALIBASE for at krydse referenceproteinsekvenser med kendte sekvenser. Flere sekvensjusteringsteknikker er angivet nedenfor.

Denne metode begynder med at udføre parvis tilpasning af sekvenser ved hjælp af k-tuple- eller Needleman – Wunsch- metoder. Disse metoder beregner en matrix, der skildrer parvis lighed mellem sekvensparene. Lighedsscores omdannes derefter til afstandsscorer, der bruges til at producere et guidetræ ved hjælp af naboens sammenføjningsmetode. Dette guidetræ anvendes derefter til at give en multipel sekvensjustering.

Clustal omega

Denne metode er i stand til at tilpasse op til 190.000 sekvenser ved at bruge k-tuple-metoden. Næste sekvenser grupperes ved hjælp af mBed- og k -means- metoderne. Et guidetræ konstrueres derefter ved hjælp af UPGMA- metoden, der bruges af HH align-pakken. Dette guidetræ bruges til at generere flere sekvensjusteringer.

MAFFT

Denne metode anvender hurtig Fourier-transformation (FFT), der konverterer aminosyresekvenser til en sekvens sammensat af volumen- og polaritetsværdier for hver aminosyrerest. Denne nye sekvens bruges til at finde homologe regioner.

K-Juster

Denne metode bruger Wu-Manber tilnærmelsesvis streng matchende algoritme til at generere flere sekvensjusteringer.

Flere sekvenssammenligning efter logforventning (MUSCLE)

Denne metode bruger Kmer- og Kimura-afstande til at generere flere sekvensjusteringer.

T-kaffe

Denne metode udnytter træbaserede objektive funktioner til tilpasningsudvikling. Denne metode har vist sig at være 5-10% mere nøjagtig end Clustal W.

Coevolutionær analyse

Coevolutionær analyse er også kendt som korreleret mutation, covariation eller co-substitution. Denne type rationelt design involverer gensidige evolutionære ændringer på evolutionært interagerende steder. Generelt begynder denne metode med genereringen af ​​en kurateret multipel sekvensopretning for målsekvensen. Denne tilpasning underkastes derefter manuel forfining, der involverer fjernelse af stærkt gappede sekvenser såvel som sekvenser med lav sekvensidentitet. Dette trin øger kvaliteten af ​​justeringen. Dernæst anvendes den manuelt bearbejdede tilpasning til yderligere coevolutionære målinger ved hjælp af forskellige korrelerede mutationsalgoritmer. Disse algoritmer resulterer i en coevolution-scoringsmatrix. Denne matrix filtreres ved at anvende forskellige signifikansetest for at udtrække betydelige coevolution-værdier og udslette baggrundsstøj. Coevolutionære målinger evalueres yderligere for at vurdere deres præstationer og stringens. Endelig er resultaterne fra denne coevolutionære analyse valideret eksperimentelt.

Strukturel forudsigelse

De novo- syntese af protein drager fordel af viden om eksisterende proteinstrukturer. Denne viden om eksisterende proteinstruktur hjælper med forudsigelsen af ​​nye proteinstrukturer. Metoder til forudsigelse af proteinstruktur falder ind under en af ​​de fire følgende klasser: ab initio, fragmentbaserede metoder, homologimodellering og proteintrådning.

Ab initio

Disse metoder involverer gratis modellering uden brug af strukturelle oplysninger om skabelonen. Ab initio- metoder er rettet mod forudsigelse af de oprindelige strukturer af proteiner, der svarer til det globale minimum af dets frie energi. nogle eksempler på ab initio- metoder er AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS og ENCEPP12. Generelle trin til ab initio- metoder begynder med den geometriske repræsentation af proteinet af interesse. Dernæst udvikles en potentiel energifunktionsmodel for proteinet. Denne model kan oprettes ved hjælp af enten molekylære mekaniske potentialer eller proteinstruktur afledte potentielle funktioner. Efter udviklingen af ​​en potentiel model anvendes energisøgningsteknikker inklusive molekylære dynamiske simuleringer, Monte Carlo simuleringer og genetiske algoritmer på proteinet.

Fragmentbaseret

Disse metoder bruger databaseinformation vedrørende strukturer til at matche homologe strukturer til de oprettede proteinsekvenser. Disse homologe strukturer er samlet for at give kompakte strukturer ved hjælp af scorings- og optimeringsprocedurer med det formål at opnå den laveste potentielle energipoints. Webservere til fragmentinformation er I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM og ANGLOR.

Homologimodellering

Disse metoder er baseret på proteinernes homologi. Disse metoder er også kendt som komparativ modellering. Det første trin i homologimodellering er generelt identifikationen af ​​skabelonsekvenser med kendt struktur, som er homologe med forespørgselssekvensen. Derefter justeres forespørgselssekvensen til skabelonsekvensen. Efter justeringen modelleres de strukturelt bevarede regioner ved hjælp af skabelonstrukturen. Dette efterfølges af modellering af sidekæder og løkker, der adskiller sig fra skabelonen. Endelig gennemgår den modellerede struktur forfining og vurdering af kvalitet. Servere, der er tilgængelige til homologimodelleringsdata, er angivet her: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA og I-TASSER.

Protein trådning

Proteintrådning kan bruges, når en pålidelig homolog til forespørgselssekvensen ikke kan findes. Denne metode begynder med at opnå en forespørgselssekvens og et bibliotek med skabelonstrukturer. Dernæst trådes forespørgselssekvensen over kendte skabelonstrukturer. Disse kandidatmodeller scorer ved hjælp af scoringsfunktioner. Disse scorer baseret på potentielle energimodeller for både forespørgsel og skabelonsekvens. Derefter vælges matchet med den lavest mulige energimodel. Metoder og servere til at hente tråddata og udføre beregninger er angivet her: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP server, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED , RAPTOR, COTH, MUSTER.

For mere information om rationelt design se stedstyret mutagenese .

Rettet evolution

I rettet evolution påføres tilfældig mutagenese , fx ved fejludsat PCR eller sekvensmætningsmutagenese , på et protein, og et selektionsregime anvendes til at vælge varianter, der har de ønskede egenskaber. Yderligere runder med mutation og selektion anvendes derefter. Denne metode efterligner naturlig udvikling og producerer generelt bedre resultater end rationelt design. En tilføjet proces, kaldet DNA-blanding , blander og matcher stykker af vellykkede varianter for at give bedre resultater. Sådanne processer efterligner den rekombination, der forekommer naturligt under seksuel reproduktion . Fordele ved rettet udvikling er, at det ikke kræver nogen forudgående strukturel viden om et protein, og det er heller ikke nødvendigt at være i stand til at forudsige, hvilken effekt en given mutation vil have. Faktisk er resultaterne af rettet evolution eksperimenter ofte overraskende, idet ønskede ændringer ofte skyldes mutationer, som ikke forventes at have en eller anden effekt. Ulempen er, at de kræver screening med høj kapacitet , hvilket ikke er muligt for alle proteiner. Store mængder rekombinant DNA skal muteres, og produkterne screenes for ønskede egenskaber. Det store antal varianter kræver ofte dyrt robotudstyr for at automatisere processen. Yderligere kan ikke alle ønskede aktiviteter let screenes for.

Naturlig darwinistisk udvikling kan efterlignes effektivt i laboratoriet mod skræddersyede proteineegenskaber til forskellige anvendelser, herunder katalyse. Der findes mange eksperimentelle teknologier til at producere store og forskellige proteinbiblioteker og til screening eller valg af foldede, funktionelle varianter. Foldede proteiner opstår overraskende hyppigt i tilfældigt sekvensrum, en forekomst, der kan udnyttes i udviklende selektive bindere og katalysatorer. Mens mere konservativ end direkte udvælgelse fra dybt sekvensrum, er redesign af eksisterende proteiner ved tilfældig mutagenese og selektion / screening en særligt robust metode til optimering eller ændring af bevarede egenskaber. Det repræsenterer også et glimrende udgangspunkt for at nå mere ambitiøse tekniske mål. Alligering af eksperimentel udvikling med moderne beregningsmetoder er sandsynligvis den bredeste, mest frugtbare strategi til generering af funktionelle makromolekyler, der er ukendte for naturen.

De største udfordringer ved at designe mutantbiblioteker af høj kvalitet har vist betydelige fremskridt i den seneste tid. Dette fremskridt har været i form af bedre beskrivelser af virkningerne af mutationsbelastninger på proteinegenskaber. Også beregningsmetoder har vist store fremskridt i det utallige store sekvensrum til mere håndterbare screenbare størrelser og derved skabt smarte biblioteker af mutanter. Biblioteksstørrelse er også blevet reduceret til mere screenbare størrelser ved identifikation af vigtige gavnlige rester ved anvendelse af algoritmer til systematisk rekombination. Endelig er der taget et betydeligt skridt fremad mod effektiv genudvikling af enzymer med udviklingen af ​​mere nøjagtige statistiske modeller og algoritmer, der kvantificerer og forudsiger koblede mutationseffekter på proteinfunktioner.

Generelt kan styret evolution opsummeres som en iterativ totrinsproces, der involverer dannelse af proteinmutantbiblioteker og screeningsprocesser med høj kapacitet til valg af varianter med forbedrede egenskaber. Denne teknik kræver ikke forudgående kendskab til proteinstrukturen og funktionsforholdet. Rettet udvikling anvender tilfældig eller fokuseret mutagenese til at generere biblioteker med mutante proteiner. Tilfældige mutationer kan introduceres ved hjælp af enten fejludsat PCR eller mutation af stedmætning. Mutanter kan også genereres ved anvendelse af rekombination af multiple homologe gener. Naturen har udviklet et begrænset antal gavnlige sekvenser. Rettet udvikling gør det muligt at identificere uopdagede proteinsekvenser, som har nye funktioner. Denne evne er afhængig af proteiners evne til at tolerere aminosyrerestersubstitutioner uden at kompromittere foldning eller stabilitet.

Retningsudviklingsmetoder kan bredt kategoriseres i to strategier, aseksuelle og seksuelle metoder.

Aseksuelle metoder

Aseksuelle metoder genererer ingen krydsforbindelser mellem forældrenes gener. Enkeltgener bruges til at skabe mutante biblioteker ved hjælp af forskellige mutagene teknikker. Disse aseksuelle metoder kan producere enten tilfældig eller fokuseret mutagenese.

Tilfældig mutagenese

Tilfældige mutagene metoder producerer mutationer tilfældigt i hele genet af interesse. Tilfældig mutagenese kan introducere følgende typer mutationer: overgange, transversioner, indsættelser, sletninger, inversion, missense og nonsens. Eksempler på fremgangsmåder til fremstilling af tilfældig mutagenese er nedenfor.

Fejl udsat for PCR

Fejludsat PCR anvender det faktum, at Taq DNA-polymerase mangler 3 'til 5' exonukleaseaktivitet. Dette resulterer i en fejlrate på 0,001-0,002% pr. Nukleotid pr. Replikation. Denne metode begynder med at vælge genet eller området i et gen, man ønsker at mutere. Dernæst beregnes omfanget af den krævede fejl baseret på typen og omfanget af aktivitet, man ønsker at generere. Dette omfang af fejl bestemmer den fejlbehæftede PCR-strategi, der skal anvendes. Efter PCR klones generne i et plasmid og indføres i kompetente cellesystemer. Disse celler screenes derefter for ønskede træk. Plasmider isoleres derefter for kolonier, der viser forbedrede træk, og bruges derefter som skabeloner den næste runde af mutagenese. Fejludsat PCR viser forspændinger for bestemte mutationer i forhold til andre. Såsom bias for overgange over transversioner.

Fejlfrekvenser i PCR kan øges på følgende måder:

1. Forøg koncentrationen af ​​magnesiumchlorid, hvilket stabiliserer ikke-komplementær baseparring.
2. Tilsæt manganchlorid for at reducere baseparets specificitet.
3. Øget og ubalanceret tilføjelse af dNTP'er.
4. Tilføjelse af basisanaloger som dITP, 8 oxo-dGTP og dPTP.
5. Forøg koncentrationen af ​​Taq-polymerase.
6. Forøg forlængelsestiden.
7. Forøg cyklustiden.
8. Brug mindre nøjagtig Taq-polymerase.

Se også polymerasekædereaktion for mere information.

Rulende cirkel fejludsat PCR

Denne PCR-metode er baseret på amplificering af rullende cirkler, som er modelleret ud fra den metode, som bakterier bruger til at amplificere cirkulært DNA. Denne metode resulterer i lineære DNA-duplekser. Disse fragmenter indeholder tandem-gentagelser af cirkulært DNA kaldet concatamerer, som kan omdannes til bakteriestammer. Mutationer introduceres ved først at klone målsekvensen i et passende plasmid. Dernæst begynder amplifikationsprocessen ved anvendelse af tilfældige hexamerprimere og ~ 29 DNA-polymerase under betingelser, der er tilbøjelige til amplificering af rullende cirkler. Supplerende betingelser være producere fejltilbøjelige rolling circle-amplifikation er 1,5 pM skabelon-DNA, 1,5 mM MnCl ₂ og en 24 timers reaktionstid. MnCl ₂ tilsættes til reaktionsblandingen for at fremme tilfældige punktmutationer i DNA-strengene. Mutationsrater kan forøges ved at forøge koncentrationen af MnC ₂ , eller ved at reducere koncentrationen af template-DNA'et. Fejl udsat rullende cirkelforstærkning er fordelagtig i forhold til fejludsat PCR på grund af dens anvendelse af universelle tilfældige hexamerprimere snarere end specifikke primere. Også reaktionsprodukterne fra denne amplifikation behøver ikke at blive behandlet med ligaser eller endonukleaser. Denne reaktion er isoterm.

Kemisk mutagenese

Kemisk mutagenese involverer brugen af ​​kemiske midler til at indføre mutationer i genetiske sekvenser. Eksempler på kemiske mutagener følger.

Natriumbisulfat er effektivt til at mutere G / C-rige genomiske sekvenser. Dette skyldes, at natriumbisulfat katalyserer deaminering af umetyleret cytosin til uracil.

Ethylmethansulfonat alkylerer guanidinrester. Denne ændring forårsager fejl under DNA-replikering.

Salpetersyre forårsager transversion ved deaminering af adenin og cytosin.

Den dobbelte tilgang til tilfældig kemisk mutagenese er en iterativ totrinsproces. Først involverer den in vivo kemisk mutagenese af genet af interesse via EMS. Dernæst isoleres det behandlede gen og kloning i en ubehandlet ekspressionsvektor for at forhindre mutationer i plasmidrygraden. Denne teknik bevarer plasmidernes genetiske egenskaber.

Målretning af glycosylaser til indlejrede arrays til mutagenese (TaGTEAM)

Denne metode er blevet brugt til at skabe målrettet in vivo mutagenese i gær. Denne metode involverer fusion af en 3-methyladenin-DNA-glycosylase til tetR-DNA-bindende domæne. Dette har vist sig at øge mutationshastigheder med over 800 tid i regioner i genomet, der indeholder tetO-steder.

Mutagenese ved tilfældig indsættelse og sletning

Denne metode involverer ændring i længden af ​​sekvensen via samtidig sletning og indsættelse af klumper af baser med vilkårlig længde. Denne metode har vist sig at producere proteiner med nye funktionaliteter via introduktion af nye restriktionssteder, specifikke kodoner, fire basekodoner for ikke-naturlige aminosyrer.

Transposonbaseret tilfældig mutagenese

For nylig er der rapporteret om mange metoder til transposonbaseret tilfældig mutagenese. Disse metoder indbefatter, men er ikke begrænset til følgende: PERMUTE-tilfældig cirkulær permutation, tilfældig proteintunkering, tilfældig nukleotidtripletsubstitution, tilfældig domæne / tag / multipel aminosyreindsættelse, codonscannende mutagenese og multicodon-scanningsmutagenese. Disse førnævnte teknikker kræver alle design af mini-Mu transposoner. Thermo Scientific fremstiller sæt til design af disse transponer.

Tilfældige mutagenesemetoder, der ændrer mål-DNA-længden

Disse metoder involverer ændring af genlængde via insertions- og deletionsmutationer. Et eksempel er metoden tandem gentagelse (TRINS). Denne teknik resulterer i dannelsen af ​​tandem-gentagelser af tilfældige fragmenter af målgenet via rullende cirkelamplifikation og samtidig inkorporering af disse gentagelser i målgenet.

Mutatorstammer

Mutatorstammer er bakteriecellelinier, som mangler en eller flere DNA-reparationsmekanismer. Et eksempel på en mutatorstreng er E. coli XL1-RED. Denne underordnede stamme af E. coli er mangelfuld i MutS, MutD, MutT DNA reparationsveje. Anvendelse af mutatorstammer er nyttigt ved introduktion af mange typer mutationer; disse stammer viser imidlertid progressiv sygdom i kultur på grund af akkumulering af mutationer i stammens eget genom.

Fokuseret mutagenese

Fokuserede mutagene metoder producerer mutationer ved forudbestemte aminosyrerester. Disse teknikker kræver og forståelse af sekvens-funktionsforholdet for proteinet af interesse. Forståelse af dette forhold muliggør identifikation af rester, som er vigtige med hensyn til stabilitet, stereoselektivitet og katalytisk effektivitet. Eksempler på metoder, der producerer fokuseret mutagenese, er nedenfor.

Mutagenese af stedmætning

Stedsmætningsmutagenese er en PCR-baseret metode, der anvendes til at målrette aminosyrer med betydelige roller i proteinfunktion. De to mest almindelige teknikker til udførelse af dette er helplasmid-enkelt PCR og overlapningsforlængelses-PCR.

Hele plasmid enkelt PCR betegnes også som stedstyret mutagenese (SDM). SDM-produkter udsættes for Dpn-endonukleasefordøjelse. Denne fordøjelse resulterer kun i spaltning af forældrestrengen, fordi forældrestrengen indeholder en GmATC, der er methyleret ved N6 af adenin. SDM fungerer ikke godt for store plasmider på over ti kilobaser. Denne metode er også kun i stand til at erstatte to nukleotider ad gangen.

PCR med forlængelsesudvidelse kræver brug af to par primere. En primer i hvert sæt indeholder en mutation. En første PCR-runde ved anvendelse af disse primersæt udføres, og der dannes to dobbeltstrengede DNA-duplekser. En anden PCR-runde udføres derefter, hvor disse duplekser denatureres og annealeres med primersættene igen for at producere heteroduplexer, hvor hver streng har en mutation. Eventuelle huller i disse nydannede heteroduplexer er fyldt med DNA-polymeraser og yderligere amplificeret.

Sekvensmætningsmutagenese (SeSaM)

Sekvensmætningsmutagenese resulterer i randomisering af målsekvensen ved hver nukleotidposition. Denne metode begynder med genereringen af ​​DNA-fragmenter med variabel længde, der er halet med universelle baser via brugen af ​​skabelontransferaser ved 3'-terminalen. Dernæst udvides disse fragmenter til fuld længde ved hjælp af en enkeltstrenget skabelon. De universelle baser erstattes med en tilfældig standardbase, der forårsager mutationer. Der er flere modificerede versioner af denne metode, såsom SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv + og SeSAM-III.

Single primer reaktioner parallelt (SPRINP)

Denne metoden til mutation af stedmætning involverer to separate PCR-reaktioner. Den første af dem bruger kun fremadgående primere, mens den anden reaktion kun bruger omvendte primere. Dette undgår dannelsen af ​​primerdimerdannelse.

Mega-primet og ligasefri fokuseret mutagenese

Denne stedmættede mutagene teknik begynder med et mutagent oligonukleotid og en universel flankerende primer. Disse to reaktanter anvendes til en indledende PCR-cyklus. Produkter fra denne første PCR-cyklus bruges som mega-primere til den næste PCR.

Ω-PCR

Denne stedmættede mutagene metode er baseret på PCR med forlængelsesforlængelse. Det bruges til at indføre mutationer på ethvert sted i et cirkulært plasmid.

PFunkel-ominchange-OSCARR

Denne metode bruger brugerdefineret stedstyret mutagenese på enkelt eller flere steder samtidigt. OSCARR er et akronym for en enkelt potte metode til kassett randomisering og rekombination . Denne randomisering og rekombination resulterer i randomisering af ønskede fragmenter af et protein. Omnichange er en sekvensuafhængig, multisite mætningsmutagenese, som kan mætte op til fem uafhængige kodoner på et gen.

Trimer-dimer mutagenese

Denne metode fjerner overflødige kodoner og stopkodoner.

Kassette mutagenese

Dette er en PCR-baseret metode. Kassettemutagenese begynder med syntesen af ​​en DNA-kassette, der indeholder genet af interesse, som flankeres på begge sider af restriktionssteder. Endonukleasen, som spalter disse restriktionssteder, spalter også steder i målplasmidet. DNA-kassetten og målplasmidet behandles begge med endonukleaser for at spalte disse restriktionssteder og skabe klæbrige ender. Derefter ligeres produkterne fra denne spaltning sammen, hvilket resulterer i insertion af genet i målplasmidet. En alternativ form for kassette mutagenese kaldet kombinatorisk kassette mutagenese bruges til at identificere funktionerne af individuelle aminosyrerester i proteinet af interesse. Rekursivt ensemble mutagenese bruger derefter information fra tidligere kombinatorisk kassette mutagenese. Codon-kassette-mutagenese giver dig mulighed for at indsætte eller udskifte et enkelt codon på et bestemt sted i dobbeltstrenget DNA.

Seksuelle metoder

Seksuelle metoder til styret evolution involverer in vitro rekombination, som efterligner naturlig in vivo rekombination. Generelt kræver disse teknikker høj sekvenshomologi mellem forældresekvenser. Disse teknikker bruges ofte til at rekombinere to forskellige forældrenes gener, og disse metoder skaber krydsninger mellem disse gener.

In vitro homolog rekombination

Homolog rekombination kan kategoriseres som enten in vivo eller in vitro. In vitro homolog rekombination efterligner naturlig in vivo rekombination. Disse in vitro- rekombinationsmetoder kræver høj sekvenshomologi mellem forældresekvenser. Disse teknikker udnytter den naturlige mangfoldighed i forældrenes gener ved at rekombinere dem for at give kimære gener. Den resulterende kimære viser en blanding af forældrenes egenskaber.

DNA-blanding

Denne in vitro- teknik var en af ​​de første teknikker i rekombinationens æra. Det begynder med fordøjelsen af ​​homologe forældrenes gener i små fragmenter af DNase1. Disse små fragmenter oprenses derefter fra ufordøjede forældrenes gener. Oprensede fragmenter samles derefter igen ved anvendelse af primerfri PCR. Denne PCR involverer homologe fragmenter fra forskellige forældrener, der primer for hinanden, hvilket resulterer i kimærisk DNA. Det kimære DNA af forældrestørrelse amplificeres derefter ved anvendelse af endeterminaler i almindelig PCR.

Tilfældig priming in vitro- rekombination (RPR)

Denne in vitro homolog rekombinationsmetode begynder med syntesen af ​​mange korte genfragmenter, der udviser punktmutationer under anvendelse af tilfældige sekvensprimere. Disse fragmenter samles igen til forældrenes gener i fuld længde ved hjælp af primerfri PCR. Disse genmonterede sekvenser amplificeres derefter ved anvendelse af PCR og udsættes for yderligere selektionsprocesser. Denne metode er fordelagtig i forhold til DNA-blanding, fordi der ikke er nogen anvendelse af DNase1, og der er således ingen bias for rekombination ved siden af ​​et pyrimidinnukleotid. Denne metode er også fordelagtig på grund af dens anvendelse af syntetiske tilfældige primere, der er ensartede i længden og mangler forspændinger. Endelig er denne metode uafhængig af længden af ​​DNA-skabelonsekvens og kræver en lille mængde forældrenes DNA.

Afkortet metagenomisk genspecifik PCR

Denne metode genererer kimære gener direkte fra metagenomiske prøver. Det begynder med isolering af det ønskede gen ved funktionel screening fra metagenomisk DNA-prøve. Dernæst er specifikke primere designet og brugt til at amplificere de homologe gener fra forskellige miljøprøver. Endelig genereres kimære biblioteker for at hente de ønskede funktionelle kloner ved at blande disse amplificerede homologe gener.

Forskudt udvidelsesproces (STEP)

Denne in vitro- metode er baseret på skift af skabeloner for at generere kimære gener. Denne PCR-baserede metode begynder med en indledende denaturering af skabelonen efterfulgt af udglødning af primere og en kort forlængelsestid. Al efterfølgende cyklus genererer annealing mellem de korte fragmenter, der er genereret i tidligere cyklusser, og forskellige dele af skabelonen. Disse korte fragmenter og skabelonerne udglødes sammen baseret på sekvenskomplementaritet. Denne proces med fragmenter, der annealer skabelon-DNA, er kendt som skift af skabelon. Disse udglødede fragmenter vil derefter tjene som primere til yderligere udvidelse. Denne metode udføres, indtil den kimære gensekvens forældrelængde er opnået. Udførelse af denne metode kræver kun, at flankerende primere skal begynde. Der er heller ikke behov for Dnase1-enzym.

Tilfældig kimeragenese på forbigående skabeloner (RACHITT)

Denne metode har vist sig at generere kimære genbiblioteker med et gennemsnit på 14 crossovers pr. Kimært gen. Det begynder med at tilpasse fragmenter fra en forældrenes øverste streng til den nederste streng af en uracilholdig skabelon fra et homologt gen. 5 'og 3' overhængsklapper spaltes, og huller fyldes ved exonuklease- og endonukleaseaktiviteterne af Pfu og taq DNA-polymeraser. Den uracilholdige skabelon fjernes derefter fra heteroduplexet ved behandling med en uracil-DNA-glcosylase efterfulgt af yderligere amplifikation under anvendelse af PCR. Denne metode er fordelagtig, fordi den genererer kimærer med relativt høj delefrekvens. Det er dog noget begrænset på grund af kompleksiteten og behovet for dannelse af enkeltstrenget DNA og uracil indeholdende enkeltstrenget skabelon-DNA.

Syntetisk blanding

Blanding af syntetiske degenererede oligonukleotider tilføjer fleksibilitet til blandingsmetoder, da oligonukleotider indeholdende optimale kodoner og gavnlige mutationer kan inkluderes.

In vivo homolog rekombination

Kloning udført i gær involverer PCR-afhængig genmontering af fragmenterede ekspressionsvektorer. Disse genmonterede vektorer introduceres derefter til og klones i gær. Brug af gær til at klone vektoren undgår toksicitet og modselektion, der ville blive introduceret ved ligering og formering i E. coli.

Mutagen organiseret rekombinationsproces ved homolog in vivo- gruppering (MORPHING)

Denne metode introducerer mutationer i specifikke gener af regioner, mens andre dele er intakte ved anvendelse af den høje frekvens af homolog rekombination i gær.

Fagassisteret kontinuerlig udvikling (PACE)

Denne metode anvender en bakteriofag med en modificeret livscyklus til at overføre udviklende gener fra vært til vært. Fagens livscyklus er designet på en sådan måde, at overførslen er korreleret med aktiviteten af ​​interesse fra enzymet. Denne metode er fordelagtig, fordi den kræver minimal menneskelig intervention for den kontinuerlige udvikling af genet.

In vitro ikke-homologe rekombinationsmetoder

Disse metoder er baseret på det faktum, at proteiner kan udvise lignende strukturelle identitet, mens de mangler sekvenshomologi.

Exon blandet

Exon shuffling er kombinationen af ​​exoner fra forskellige proteiner ved rekombinationshændelser, der forekommer ved introner. Ortologisk exon-blanding involverer kombination af exoner fra ortologe gener fra forskellige arter. Ortolog domæne-blanding involverer blanding af hele proteindomæner fra ortologiske gener fra forskellige arter. Paralog exon-blanding involverer blanding af exon fra forskellige gener fra den samme art. Paralog domæne blander involverer blanding af hele proteindomæner fra paraloge proteiner fra den samme art. Funktionel homolog-blanding involverer blanding af ikke-homologe domæner, som er funktionelt relaterede. Alle disse processer er med amplifikation af de ønskede exoner fra forskellige gener under anvendelse af kimære syntetiske oligonukleotider. Disse amplifikationsprodukter samles derefter igen i gener i fuld længde ved anvendelse af primerfri PCR. Under disse PCR-cyklusser fungerer fragmenterne som skabeloner og primere. Dette resulterer i kimære gener i fuld længde, som derefter udsættes for screening.

Inkrementel trunkering til dannelse af hybridenzymer (ITCHY)

Fragmenter af forældrenes gener oprettes ved hjælp af kontrolleret fordøjelse ved hjælp af exonuklease III. Disse fragmenter afstumpes under anvendelse af endonuklease og ligeres til dannelse af hybridgener. THIOITCHY er en modificeret ITCHY-teknik, der anvendte nukleotidtriphosphatanaloger, såsom a-phosphothioat-dNTP'er. Inkorporering af disse nukleotider blokerer fordøjelsen ved exonuklease III. Denne hæmning af fordøjelsen ved exonuklease III kaldes spiking. Spiking kan opnås ved først at afkorte gener med exonuklease for at skabe fragmenter med korte enkeltstrengede udhæng. Disse fragmenter tjener derefter som skabeloner til amplifikation med DNA-polymerase i nærværelse af små mængder af phosphothioat-dNTP'er. Disse resulterende fragmenter ligeres derefter sammen til dannelse af gener i fuld længde. Alternativt kan de intakte forældrenes gener amplificeres ved PCR i nærvær af normale dNTP'er og phosphothioat-dNTP'er. Disse amplifikationsprodukter i fuld længde underkastes derefter fordøjelse ved en exonuklease. Fordøjelsen fortsætter, indtil exonukleasen støder på en α-pdNTP, hvilket resulterer i fragmenter af forskellig længde. Disse fragmenter ligeres derefter sammen for at generere kimære gener.

RIDENDE

Denne metode genererer biblioteker af hybridgener, der inhiberer flere crossovers ved at kombinere DNA-blanding og ITCHY. Denne metode begynder med opførelsen af ​​to uafhængige ITCHY-biblioteker. Den første med gen A på N-terminalen. Og den anden har gen B på N-terminalen. Disse hybridgenfragmenter adskilles ved anvendelse af enten restriktionsenzymfordøjelse eller PCR med terminale primere via agarosegelelektroforese. Disse isolerede fragmenter blandes derefter sammen og fordøjes yderligere under anvendelse af DNase1. Fordøjede fragmenter samles derefter igen ved primerfri PCR med skift af skabelon.

Rekombineret udvidelse på trunkerede skabeloner (RETT)

Denne metode genererer biblioteker af hybridgener ved skabelonomskiftning af ensrettet voksende polynukleotider i nærvær af enkeltstrengede DNA-fragmenter som skabeloner til kimærer. Denne metode begynder med fremstillingen af ​​enkeltstrengede DNA-fragmenter ved omvendt transkription fra mål-mRNA. Genspecifikke primere annealeres derefter til det enkeltstrengede DNA. Disse gener udvides derefter under en PCR-cyklus. Denne cyklus efterfølges af skabelonskift og annealing af de korte fragmenter opnået fra den tidligere primerforlængelse til andre enkeltstrengede DNA-fragmenter. Denne proces gentages, indtil enkeltstrenget DNA i fuld længde er opnået.

Sekvenshomologiuafhængig proteinrekombination (SHIPREC)

Denne metode genererer rekombination mellem gener med ringe eller ingen sekvenshomologi. Disse kimærer er fusioneret via en linkersekvens indeholdende flere restriktionssteder. Denne konstruktion fordøjes derefter ved hjælp af DNase1. Fragmenter fremstilles gøres stumpe ved hjælp af S1-nuklease. Disse stumpe ende-fragmenter sættes sammen til en cirkulær sekvens ved ligering. Denne cirkulære konstruktion lineariseres derefter ved anvendelse af restriktionsenzymer, for hvilke restriktionsstederne er til stede i linkerområdet. Dette resulterer i et bibliotek med kimære gener, hvor genernes bidrag til 5'- og 3'-enden vil blive vendt sammenlignet med startkonstruktionen.

Sekvensuafhængig stedstyret kimeragenese (SISDC)

Denne metode resulterer i et bibliotek med gener med flere delefilter fra flere forældrenes gener. Denne metode kræver ikke sekvensidentitet blandt forældrenes gener. Dette kræver en eller to konserverede aminosyrer ved hver crossover-position. Det begynder med tilpasning af forældresekvenser og identifikation af konsensusregioner, der fungerer som crossover-steder. Dette efterfølges af inkorporering af specifikke tags indeholdende restriktionssteder efterfulgt af fjernelse af tags ved fordøjelse med Bac1, hvilket resulterer i gener med sammenhængende ender. Disse genfragmenter blandes og ligeres i en passende rækkefølge til dannelse af kimære biblioteker.

Degenereret homo-duplex rekombination (DHR)

Denne metode begynder med tilpasning af homologe gener efterfulgt af identifikation af regioner med polymorfisme. Dernæst er den øverste streng af genet opdelt i små degenererede oligonukleotider. Bundstrengen fordøjes også i oligonukleotider for at tjene som stilladser. Disse fragmenter kombineres i opløsning, når oligonukleotider i topstreng samles på oligonukleotider i bundstreng. Huller mellem disse fragmenter er fyldt med polymerase og ligeret.

Tilfældig multi-rekombinant PCR (RM-PCR)

Denne metode involverer blanding af flertal DNA-fragmenter uden homologi i en enkelt PCR. Dette resulterer i rekonstruktion af komplette proteiner ved samling af moduler, der koder for forskellige strukturelle enheder.

Brugervenlig DNA-rekombination (USERec)

Denne metode begynder med amplifikationen af ​​genfragmenter, der skal rekombineres, ved anvendelse af uracil dNTP'er. Denne amplifikationsopløsning indeholder også primere, PfuTurbo og Cx Hotstart DNA-polymerase. Amplificerede produkter inkuberes derefter med USER-enzym. Dette enzym katalyserer fjernelsen af ​​uracilrester fra DNA, hvilket skaber enkelt basepar huller. De USER-enzymbehandlede fragmenter blandes og ligeres ved anvendelse af T4 DNA-ligase og udsættes for Dpn1-fordøjelse for at fjerne skabelon-DNA'et. Disse resulterende snoede strandede fragmenter udsættes for amplifikation under anvendelse af PCR og transformeres til E. coli.

Golden Gate shuffling (GGS) rekombination

Denne metode giver dig mulighed for at rekombinere mindst 9 forskellige fragmenter i en acceptorvektor ved hjælp af type 2 restriktionsenzym, der skærer uden for restriktionsstederne. Det begynder med subkloning af fragmenter i separate vektorer for at skabe Bsa1 flankerende sekvenser på begge sider. Disse vektorer spaltes derefter ved anvendelse af type II-restriktionsenzym Bsa1, der genererer fire nukleotid-enkeltstrengsoverhæng. Fragmenter med komplementære overhæng hybridiseres og ligeres ved anvendelse af T4 DNA-ligase. Endelig transformeres disse konstruktioner til E. coli celler, som screenes for ekspressionsniveauer.

Phosphorthioatbaseret DNA-rekombinationsmetode (PRTec)

Denne metode kan bruges til at kombinere strukturelle elementer eller hele proteindomæner. Denne metode er baseret på phosphorthioatkemi, som muliggør den specifikke spaltning af phosphorthiodiesterbindinger. Det første trin i processen begynder med amplifikation af fragmenter, der skal rekombineres sammen med vektorrygraden. Denne amplifikation opnås ved anvendelse af primere med phosphorthiolerede nukleotider i 5'-ender. Amplificerede PCR-produkter spaltes i en ethanoljodopløsning ved høje temperaturer. Dernæst hybridiseres disse fragmenter ved stuetemperatur og transformeres til E. coli, som reparerer eventuelle kryds.

Integron

Dette system er baseret på et naturligt stedsspecifikt rekombinationssystem i E. coli. Dette system kaldes integronsystemet og producerer naturlig genblanding. Denne metode blev brugt til at konstruere og optimere en funktionel tryptophan biosyntetisk operon i trp-mangelfuld E. coli ved at levere individuelle rekombinationskassetter eller trpA-E gener sammen med regulerende elementer med integronsystemet.

Y-ligeringsbaseret blanding (YLBS)

Denne fremgangsmåde genererer enkeltstrengede DNA-tråde, som omfatter en enkelt bloksekvens enten ved 5'- eller 3'-enden, komplementære sekvenser i en stamløkkeregion og en D-grenregion, der tjener som et primerbindingssted for PCR. Ækvivalente mængder af både 5 'og 3' halvstrenge blandes og dannes en hybrid på grund af komplementariteten i stilkregionen. Hybrider med fri phosphoryleret 5'-ende i 3'-halvstrenge ligeres derefter med frie 3'-ender i 5'-halvstrenge ved anvendelse af T4-DNA-ligase i nærværelse af 0,1 mM ATP. Ligerede produkter amplificeres derefter af to typer PCR for at generere præ 5 'halv og pre 3' halv PCR produkter. Disse PCR-produkter omdannes til enkeltstrenge via avidin-biotin-binding til 5'-enden af ​​primerne, der indeholder stammesekvenser, der blev biotinmærket. Dernæst anvendes biotinylerede 5 'halve tråde og ikke-biotinylerede 3' halve tråde som 5 'og 3' halve tråde til den næste Y-ligeringscyklus.

Semi-rationelt design

Semi-rationelt design bruger information om en proteinsekvens, struktur og funktion sammen med forudsigende algoritmer. Disse bruges sammen til at identificere målaminosyrerester, som mest sandsynligt påvirker proteinfunktionen. Mutationer af disse vigtige aminosyrerester skaber biblioteker med mutante proteiner, der er mere tilbøjelige til at have forbedrede egenskaber.

Fremskridt inden for semi-rationel enzymteknik og de novo enzymdesign giver forskere stærke og effektive nye strategier til at manipulere biokatalysatorer. Integration af sekvens- og strukturbaserede tilgange i biblioteksdesign har vist sig at være en god guide til enzymdesign. Generelt sammenlignes de nuværende beregningsmetoder de novo og redesign ikke med udviklede varianter i katalytisk ydeevne. Selvom eksperimentel optimering kan produceres ved hjælp af målrettet udvikling, opnås yderligere forbedringer i nøjagtigheden af ​​strukturforudsigelser og større katalytisk evne med forbedringer i designalgoritmer. Yderligere funktionelle forbedringer kan inkluderes i fremtidige simuleringer ved at integrere proteindynamik.

Biokemiske og biofysiske studier sammen med finjustering af forudsigelige rammer vil være nyttige til eksperimentelt at evaluere den funktionelle betydning af individuelle designfunktioner. Bedre forståelse af disse funktionelle bidrag vil derefter give feedback til forbedring af fremtidige design.

Direkte udvikling vil sandsynligvis ikke blive erstattet som den valgte metode til proteinteknik, selvom beregningsproteindesign fundamentalt har ændret den måde, proteinteknik kan manipulere biomakromolekyler på. Mindre, mere fokuserede og funktionelt rige biblioteker kan genereres ved anvendelse af metoder, der inkorporerer forudsigelige rammer for hypotesedrevet proteinteknik. Nye designstrategier og tekniske fremskridt er begyndt at afvige fra traditionelle protokoller, såsom rettet evolution, som repræsenterer den mest effektive strategi til at identificere kandidater, der bedst fungerer i fokuserede biblioteker. Hele genbibliotekssyntese erstatter blandings- og mutageneseprotokoller til biblioteksforberedelse. Også meget specifikke screeningsassays med lav kapacitet anvendes i stigende grad i stedet for monumental screening og udvælgelsesindsats fra millioner af kandidater. Tilsammen er denne udvikling klar til at tage proteinteknik ud over målrettet udvikling og mod praktiske, mere effektive strategier til at skræddersy biokatalysatorer.

Screening og udvælgelsesteknikker

Når et protein har gennemgået styret evolution, ration design eller semi-ration design, skal bibliotekerne af mutante proteiner screenes for at bestemme, hvilke mutanter der viser forbedrede egenskaber. Fagvisningsmetoder er en mulighed for screening af proteiner. Denne metode involverer fusion af gener, der koder for de forskellige polypeptider med fagcoateproteingener. Proteinvarianter udtrykt på fagoverflader vælges ved binding med immobiliserede mål in vitro. Fager med udvalgte proteinvarianter amplificeres derefter i bakterier efterfulgt af identifikation af positive kloner ved hjælp af enzymbundet immunosorbentassay. Disse udvalgte fager underkastes derefter DNA-sekventering.

Celleoverfladevisningssystemer kan også anvendes til at screene mutante polypeptidbiblioteker. Biblioteksmutante gener er inkorporeret i ekspressionsvektorer, som derefter transformeres til passende værtsceller. Disse værtsceller udsættes for yderligere screeningmetoder med høj gennemstrømning for at identificere cellerne med ønskede fænotyper.

Cellefrie displaysystemer er udviklet til at udnytte in vitro- proteinoversættelse eller cellefri translation. Disse fremgangsmåder inkluderer mRNA-display, ribosom-display, kovalent og ikke-kovalent DNA-display og in vitro- opdeling.

Enzymteknik

Enzymteknik er anvendelsen af ​​at modificere et enzyms struktur (og dermed dets funktion) eller at modificere den katalytiske aktivitet af isolerede enzymer til at producere nye metabolitter, at tillade nye (katalyserede) veje til reaktioner at forekomme eller at konvertere fra nogle bestemte forbindelser ind i andre ( biotransformation ). Disse produkter er nyttige som kemikalier, lægemidler, brændstof, fødevarer eller landbrugsadditiver.

En enzymreaktor består af en beholder indeholdende et reaktionsmedium, der bruges til at udføre en ønsket omdannelse på enzymatisk måde. Enzymer, der anvendes i denne proces, er gratis i løsningen.

Eksempler på konstruerede proteiner

Beregningsmetoder er blevet brugt til at designe et protein med en ny fold, kaldet Top7 , og sensorer til unaturlige molekyler. Udviklingen af fusionsproteiner har givet rilonacept , et lægemiddel, der har sikret Food and Drug Administration (FDA) godkendelse til behandling af cryopyrin-associeret periodisk syndrom .

En anden beregningsmetode, IPRO, konstruerede med succes skiftet af cofaktorspecificitet af Candida boidinii xylose-reduktase. Iterativ Protein Redesign og Optimization (IPRO) redesigner proteiner for at øge eller give specificitet til native eller nye substrater og cofaktorer . Dette gøres ved gentagne gange tilfældigt at forstyrre proteinenes struktur omkring specificerede designpositioner, identificere den laveste energikombination af rotamerer og bestemme, om det nye design har en lavere bindingsenergi end tidligere.

Beregningsstøttet design er også blevet brugt til at konstruere komplekse egenskaber ved en meget ordnet nano-protein-samling. Et proteinbur, E. coli-bakterioferritin (EcBfr), som naturligt viser strukturel ustabilitet og en ufuldstændig selvmonteringsadfærd ved at udfylde to oligomeriseringstilstande, er modelproteinet i denne undersøgelse. Gennem beregningsanalyse og sammenligning med dets homologer har det vist sig, at dette protein har en mindre end gennemsnitlig dimer-grænseflade på sin tofoldige symmetriakse, hovedsagelig på grund af eksistensen af ​​en grænseflade-vandlomme centreret på to vandbroede asparaginrester . For at undersøge muligheden for at konstruere EcBfr for modificeret strukturel stabilitet anvendes en semi-empirisk beregningsmetode til næsten at udforske energiforskellene mellem de 480 mulige mutanter ved den dimere grænseflade i forhold til vildtype EcBfr. Denne beregningsundersøgelse konvergerer også på de vandforbundne asparaginer . Udskiftning af disse to asparaginer med hydrofobe aminosyrer resulterer i proteiner, der foldes til alfa-spiralformede monomerer og samles i bure som det fremgår af cirkulær dikroisme og transmissionselektronmikroskopi. Både termisk og kemisk denaturering bekræfter, at alle redesignede proteiner i overensstemmelse med beregningerne har øget stabilitet. En af de tre mutationer skifter populationen til fordel for oligomeriseringstilstanden af ​​højere orden i opløsning som vist ved både størrelseseksklusionskromatografi og nativ gelelektroforese.

En in silico- metode, PoreDesigner, blev med succes udviklet til at redesigne bakteriekanalprotein (OmpF) for at reducere dets porestørrelse på 1 nm til enhver ønsket sub-nm-dimension. Transporteksperimenter på de smaleste designede porer afslørede fuldstændig saltafvisning, når de blev samlet i biomimetiske blokpolymermatricer.

Se også

Referencer

eksterne links

• servere til proteinteknik og relaterede emner baseret på WHAT IF-softwaren
• Enzymer bygget fra bunden - Forskere konstruerer aldrig før set katalysatorer ved hjælp af en ny beregningsteknik, Technology Review , 10. marts 2008