Visualizzazione dei fagi

Il phage display ( english phage display ) è un metodo biotecnologico di grandi dimensioni, nelle librerie ricombinanti vengono presentati peptidi (z. B., porzioni proteiche frammenti di anticorpi ) o proteine complete funzionalmente sulla superficie del batteriofago , specifiche per poi legarsi opportunamente partner per un Isolare e identificare i ligandi . Il phage display viene utilizzato per la delucidazione delle interazioni proteina-proteina e per lo sviluppo di nuovi farmaci biologici e di grande importanza per la ricerca di anticorpi specifici per applicazioni terapeutiche, diagnostiche o sperimentali.

Il metodo è stato introdotto come prima forma di tecnica di visualizzazione molecolare da George P. Smith nel 1985. Ha ricevuto il Premio Nobel per la chimica nel 2018 insieme a Greg Winter , che ha ulteriormente sviluppato la tecnologia in modo che anche parti di anticorpi umani fossero presentate nella visualizzazione dei fagi.

principio

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Schema generale del biopanning in vitro come elemento centrale della visualizzazione dei fagi

Il principio della visualizzazione molecolare si basa sulla presenza comune di una proteina e del suo DNA codificante in una particella (in questo caso batteriofagi ), per cui un partner di interazione da una miscela di batteriofagi transgenici basato sul legame a una proteina già presente (o altra molecola) può essere isolata, il cui DNA è poi anche disponibile. La sequenza di DNA corrispondente alla proteina di superficie ricombinante viene quindi estratta, amplificata mediante PCR e sequenziata mediante sequenziamento del DNA . La sequenza amminoacidica della proteina legante è quindi nota anche tramite il codice genetico .

Nel caso della visualizzazione fagica, diverse sequenze di DNA arbitrarie vengono solitamente ligate in parallelo alla sequenza di DNA di una proteina dell'involucro nel genoma del batteriofago o in un fagemide , in modo che le proteine ​​o i peptidi codificati in questa sequenza siano N-terminali come una proteina di fusione sulla superficie del batteriofago da presentare. La presentazione delle proteine ​​sulla superficie permette una selezione dei fagi per l' affinità ad una specifica molecola. Di conseguenza, i batteriofagi ricombinanti possono essere generati e isolati da qualsiasi miscela di sequenze di DNA che, a causa della loro proteina di fusione, possono legarsi a una molecola per la quale si cerca un partner di interazione.

La visualizzazione dei fagi può essere eseguita con fagi filamentosi (famiglia Inoviridae , es. Genere Inovirus con fagi f1, fagi M13 o fagi fd), con fagi T4 e T6 ( Myoviridae ), con fagi λ ( Siphoviridae ) o con fagi T7 ( Podoviridae ). Di conseguenza, la proteina g3p (sinonimo pIII, minor coat protein , vedi sotto) è usata principalmente per i fagi filamentosi e più raramente pVI, pVII, pVIII (( major coat protein , MCP) o pIX sono usati come partner di fusione sulla superficie del virus , con i fagi T4 principalmente Soc o Hoc usati come proteina di fusione.

L'assemblaggio dei batteriofagi avviene nei batteri . Per assemblare un fago filamentoso, le proteine ​​della membrana virale devono prima essere incorporate nella membrana cellulare batterica per assemblarle con il capside . Nei batteri esistono tre sistemi per la secrezione delle proteine ​​di membrana, il sistema Sec , il sistema SRP e il sistema TAT . Al contrario, l' uso di fagi litici come i fagi T4, T6, T7 o λ non richiede la conservazione di proteine ​​virali nella membrana cellulare.

I sistemi Sec e SRP dispiegano una proteina per la traslocazione attraverso la membrana cellulare. Al contrario, il sistema TAT è più facile da saturare , ma può spostare proteine ​​ripiegate fino a 180  kilodalton attraverso la membrana. Inoltre, nel sistema TAT, il ripiegamento delle proteine ​​può già avvenire nell'ambiente riducente del citosol , che può essere necessario per il corretto ripiegamento delle proteine ​​citosoliche, perché i ponti disolfuro indesiderati possono formarsi all'esterno della membrana cellulare (nel periplasma ) , che può impedire la piegatura corretta. Con i fagi litici non c'è problema con il misfolding proteico causato dai ponti disolfuro, poiché sono assemblati nel citosol, dove non possono sorgere ponti disolfuro a causa dell'ambiente riducente.

Visualizzazione dei fagi da librerie di anticorpi

In primo luogo, le cellule B che producono anticorpi (plasmacellule) vengono isolate dal sangue, dal midollo osseo o dai linfonodi di un donatore. L' mRNA viene ottenuto da questo e trascritto in cDNA . Con l'aiuto della reazione a catena della polimerasi (PCR), i geni della catena leggera (V L ) e della catena pesante (V H ) degli anticorpi vengono moltiplicati dal cDNA . Ogni insieme di geni (V L e V H ) è (con il gene troncato della proteina di rivestimento pIII proteina di rivestimento minore , MCP) del fago M13 (genere Inovirus ) in uno speciale vettore fagemide ligato ed Escherichia coli così trasformato . Di conseguenza, i batteri E. coli esprimono proteine ​​di fusione pIII con frammenti di scFv o frammenti di anticorpi Fab . Le proteine ​​di fusione vengono trasportate nel periplasma da un peptide segnale (derivato da pelB o ompA ) , dove si piegano in un frammento funzionale scFv o Fab collegato da un ponte disolfuro. Le parti Fv e Fab rimangono inizialmente ancorate nella membrana interna di E. coli attraverso il frammento pIII e si legano al capside quando l'assemblaggio del fago è completo.

Dopo la coinfezione con un fago helper M13 (per l'espressione del pIII non modificato e delle altre proteine ​​fagiche), il frammento di anticorpo funzionale viene incorporato nell'involucro esterno dei fagi neoformati durante il processo di maturazione tramite la proteina di rivestimento pIII, che è normalmente responsabile dell'infezione dei batteri. Allo stesso tempo, il fagema con le informazioni genetiche associate per il frammento di anticorpo corrispondente viene incorporato all'interno del fago appena formato. Ciascuno di questi fagi ricombinanti ha teoricamente un frammento di anticorpo diverso sulla sua superficie e allo stesso tempo i geni associati (V L e V H ) all'interno, paragonabili ai miliardi di cellule B nel corpo (umano).

In quello che è noto come biopanning , i fagi "leganti" possono essere pescati da miliardi di volte lo sfondo dei fagi irrilevanti ( libreria genetica ) attraverso i frammenti di anticorpi esposti sulla superficie interagendo con ligandi fissi ( antigeni ) .

I geni degli anticorpi associati possono essere facilmente isolati e sequenziati dai fagi dell'anticorpo “monoclonale” isolati in questo modo. I frammenti di anticorpi selezionati possono anche essere prodotti come proteine ​​solubili per applicazioni speciali in colture di massa in E. coli o altri sistemi cellulari.

Visualizzazione dei fagi da librerie di peptidi

Allo stesso modo degli anticorpi, è possibile selezionare sequenze peptidiche (da 9 a 12 residui di amminoacidi ) in base alla loro affinità per determinate molecole bersaglio.

Questa tecnica è utile per selezionare piccole molecole che in seguito si dimostreranno più facili da usare come farmaci rispetto a molecole più grandi come B. può usare anticorpi o altre proteine.

Un'altra possibile applicazione per le librerie di peptidi è la determinazione delle sequenze epitopiche negli anticorpi monoclonali.

Visualizzazione dei fagi da librerie di cDNA

Anche la rappresentazione delle librerie di espressione di cDNA sui fagi non è stata utilizzata molto finora . Poiché i codoni di stop si trovano spesso nelle sequenze di molte librerie , non è possibile unire le sequenze delle librerie davanti alla proteina pIII dei fagi filamentosi.

Pertanto, in alternativa, vengono utilizzati fagi litici o l' assemblaggio non covalente della proteina dalla sequenza di DNA inserita e pIII da fagi filamentosi, denominati sistema Jun / Fos . Nel sistema Jun / Fos, Jun viene prima accoppiato alla proteina pIII. Sullo stesso fagema , Fos è posto davanti alle sequenze da esprimere . Poiché entrambe le proteine ​​sono contenute su un fagemide, entrambe le proteine ​​vengono espresse contemporaneamente, Jun e Fos dimerizzano tramite la loro cerniera leucina e in questo modo accoppiano la proteina pIII alla sequenza di cDNA espressa.

Applicazioni e prospettive

La visualizzazione dei fagi è una tecnica basata sulle interazioni proteina-proteina ed è quindi adatta come metodo per rilevare le interazioni tra le proteine. Le tecniche di visualizzazione hanno reso possibile per la prima volta la produzione e la caratterizzazione di molti nuovi anticorpi umani. Altre proteine, ad es. B. sotto forma di librerie di cDNA, può essere selezionato nella visualizzazione dei fagi. L'affinità degli anticorpi selezionati può essere aumentata mediante mutagenesi. Ci sono stati molti miglioramenti nelle tecniche negli ultimi anni, ma la visualizzazione dei fagi è tutt'altro che di routine. Diverse aziende stanno ora offrendo, da molto grandi, ad es. Le librerie di visualizzazione dei fagi semi-sintetiche di T. producono anticorpi contro praticamente qualsiasi antigene. Gli anticorpi ricombinanti costituiscono circa il 30% di tutti i prodotti biofarmaceutici attualmente in fase di sperimentazione clinica ; questo mostra il potenziale per la crescita della biotecnologia nella produzione di questi prodotti.

Prove individuali

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