Fagvisning

Den fag-display ( engelsk fagfremvisning ) er en bioteknologisk metode af store, i de rekombinante biblioteker peptider (z. B., proteindele antistoffragmenter ) eller komplette proteiner funktionelt på overfladen af bakteriofager præsenteres, specifik for derefter egnet binding partner for et isolat og identificere ligander . Fagvisningen bruges til belysning af protein-protein-interaktioner og til udvikling af nye biologiske lægemidler og af stor betydning for søgningen efter specifikke antistoffer til terapeutisk, diagnostisk eller eksperimentel anvendelse.

Metoden blev introduceret som den første form for molekylær displayteknik af George P. Smith i 1985. Han modtog Nobelprisen for kemi i 2018 sammen med Greg Winter , som videreudviklede teknologien, så dele af humane antistoffer også blev præsenteret i fagdisplayet.

princip

Image
Generel skema for in vitro biopanning som et centralt element i fagdisplayet

Princippet for den molekylære skærm er baseret på den almindelige forekomst af et protein og dets kodende DNA i en partikel (i dette tilfælde bakteriofager ), hvorved en interaktionspartner fra en blanding af transgene bakteriofager baseret på binding til et allerede tilstedeværende protein (eller andet molekyle) kan isoleres, hvis DNA derefter også er tilgængeligt. DNA-sekvensen svarende til det rekombinante overfladeprotein ekstraheres derefter, amplificeres ved PCR og sekventeres ved DNA-sekventering . Aminosyresekvensen af det bindende protein er derefter også kendt via den genetiske kode .

I tilfælde af fagdisplay ligeres adskillige vilkårlige DNA-sekvenser sædvanligvis ligeret parallelt med DNA-sekvensen for et kappeprotein i genomet af bakteriofagen eller i et fagmid , således at proteinerne eller peptiderne kodet i denne sekvens er N-terminalt som et fusionsprotein på overfladen af ​​bakteriofagen for at blive præsenteret. Præsentationen af ​​proteinerne på overfladen tillader et valg af fagerne til affiniteten til et specifikt molekyle. Som et resultat kan rekombinante bakteriofager genereres og isoleres fra enhver blanding af DNA-sekvenser, som på grund af deres fusionsprotein kan binde til et molekyle, for hvilket der søges en interaktionspartner.

Fagvisningen kan udføres med filamentøse fager (familie Inoviridae , f.eks. Slægt Inovirus med f1-fager, M13-fager eller fd-fager), med T4- og T6-fager ( Myoviridae ), med λ-fager ( Siphoviridae ) eller med T7-fager ( Podoviridae) ). Tilsvarende anvendes proteinet g3p (synonym pIII, mindre kappeprotein , se nedenfor) for det meste til filamentøse fager , og mere sjældent anvendes pVI, pVII, pVIII (( major coat protein , MCP) eller pIX som fusionspartnere på virusoverfladen med T4-fager hovedsagelig Soc eller Hoc anvendt som et fusionsprotein.

Samlingen af ​​bakteriofagerne finder sted i bakterier . I For at samle en filamentøs fag, virale membranproteiner først skal inkorporeres i det bakterielle cellemembran i for at samle dér med capsid . I bakterier er der tre systemer til udskillelse af membranproteiner, Sec-systemet , SRP- systemet og TAT- systemet. I modsætning hertil kræver anvendelsen af lytiske fager, såsom T4, T6, T7 eller λ-fager, ikke opbevaring af virale proteiner i cellemembranen.

Sec- og SRP-systemerne udfolder et protein til translokation gennem cellemembranen. I modsætning hertil er TAT-systemet lettere at mætte , men det kan flytte foldede proteiner på op til 180  kilodalton over membranen. Desuden kan proteinfoldning i TAT-systemet allerede finde sted i cytosolens reducerende miljø , hvilket kan være nødvendigt for korrekt foldning af cytosoliske proteiner, fordi uønskede disulfidbroer kan dannes uden for cellemembranen (i periplasmaet ) , som kan forhindre korrekt foldning. Med de lytiske fager er der ikke noget problem med misfoldning af proteiner forårsaget af disulfidbroer, da de samles i cytosolen, hvor der ikke kan opstå nogen disulfidbroer på grund af det reducerende miljø.

Fagvisning fra antistofbiblioteker

For det første isoleres antistofproducerende B-celler (plasmaceller) fra blod, knoglemarv eller lymfeknuder fra en donor. Den mRNA opnået fra dette og transkriberet i cDNA . Ved hjælp af polymerasekædereaktionen (PCR), de gener af lyset (V L ) og tunge kæde (V H er) af antistofferne multipliceret fra cDNA . Hvert sæt af gener (V L og V H ) er (med den trunkerede gen af kappeproteinet plll mindre kappeprotein , MCP) af M13 -fag (slægt Inovirus ) i en speciel vektor phagmid ligerede og Escherichia coli således transformeret . Som et resultat udtrykker E. coli- bakterierne pIII- fusionsproteiner med scFv-fragmenter eller Fab-antistoffragmenter . Fusionsproteinerne transporteres ind i periplasmaet af et signalpeptid (afledt af pelB eller ompA ) , hvor de foldes ind i et funktionelt scFv- eller Fab-fragment bundet af en disulfidbro. Fv- og Fab-delene forbliver oprindeligt forankret i den indre E. coli- membran via pIII-fragmentet og binder til kapsidet, når samlingen af ​​fagen er afsluttet.

Efter co-infektion med en M13 hjælperfag (til ekspression af det umodificerede pIII og de andre fagproteiner) inkorporeres det funktionelle antistoffragment i den ydre hylster af nydannede fager under modningsprocessen via coatproteinet pIII, som er normalt ansvarlig for infektionen af ​​bakterierne. På samme tid inkorporeres fagmid med den tilknyttede genetiske information for det tilsvarende antistoffragment i det indre af den nydannede fag. Hver af disse rekombinante fager teoretisk har en anden antistoffragment på sin overflade og på samme tid de tilhørende gener (V L og V H ) inde, kan sammenlignes med de milliarder af B-celler i (human) krop.

I det, der er kendt som biopanning , kan de "bindende" fager fiskes ud af milliarder gange baggrunden for de irrelevante fager ( genbiblioteket ) via antistoffragmenterne eksponeret på overfladen ved at interagere med faste ligander ( antigener ) .

De associerede antistofgener kan let isoleres og sekventeres fra de "monoklonale" antistoffager isoleret på denne måde. De valgte antistoffragmenter kan også produceres som opløselige proteiner til specielle anvendelser i massekultur i E. coli eller andre cellesystemer.

Fagvisning fra peptidbiblioteker

På samme måde som med antistoffer er det muligt at vælge peptidsekvenser (9 til 12 aminosyrerester ) baseret på deres affinitet for bestemte målmolekyler.

Denne teknik er nyttig til at udvælge små molekyler, som senere viser sig lettere at bruge som medicin end større molekyler som f.eks B. kan bruge antistoffer eller andre proteiner.

En anden mulig anvendelse til peptidbiblioteker er bestemmelse af epitopsekvenser i monoklonale antistoffer.

Fagvisning fra cDNA-biblioteker

Repræsentationen af cDNA- ekspressionsbiblioteker på fager er heller ikke blevet brugt meget indtil videre . Da stopkodoner ofte forekommer i sekvenserne af mange biblioteker , er det ikke muligt at forbinde bibliotekssekvenserne foran pIII-proteinet i filamentøse fager.

Derfor anvendes som et alternativ lytiske fager eller den ikke-kovalente samling af proteinet fra den indsatte DNA-sekvens og pIII fra filamentøse fager, benævnt Jun / Fos-systemet . I Jun / Fos-systemet kobles Jun først til pIII-proteinet. På det samme fagmid placeres Fos foran de sekvenser, der skal udtrykkes . Da begge proteiner er indeholdt på et fagemid, udtrykkes begge proteiner på samme tid, Jun og Fos dimeriseres via deres leucin-lynlås og kobler pIII-proteinet på denne måde til den udtrykte cDNA-sekvens.

Anvendelser og perspektiver

Fagvisning er en teknik baseret på protein-protein-interaktioner og er derfor velegnet som en metode til påvisning af interaktioner mellem proteiner. Displayteknikker gjorde det muligt for første gang at producere og karakterisere mange nye humane antistoffer. Andre proteiner, f.eks. B. i form af cDNA-biblioteker kan vælges i fagvisningen. Affiniteten af ​​de valgte antistoffer kan øges ved mutagenese. Der har været mange forbedringer i teknikker i de senere år, men fagvisning er langt fra rutinemæssig. Flere virksomheder tilbyder nu, fra meget store, f.eks. T. halvsyntetiske fagdisplaybiblioteker producerer antistoffer mod stort set ethvert antigen. Rekombinante antistoffer udgør ca. 30% af alle biofarmaceutiske lægemidler, der i øjeblikket er i klinisk test ; dette viser potentialet for vækst inden for bioteknologi i produktionen af ​​disse produkter.

Individuelle beviser

  1. ^ GP Smith: Filamentøs fusionsfage: Nye ekspressionsvektorer, der viser klonede antigener på Virion-overfladen . I: Videnskab . bånd 228 , nr. 4705 , 14. juni 1985, s. 1315-1317 , doi : 10.1126 / science.4001944 .
  2. ↑ a b c W. Li, N.B. Caberoy: Nyt perspektiv for fagvisning som en effektiv og alsidig teknologi til funktionel proteomik. I: Appl Microbiol Biotechnol. (2010), bind 85 (4), s. 909-919. PMID 19885657 ; PMC 2992952 (fri fuld tekst).
  3. ↑ J. W. Kehoe, B. K. Kay: Filamentøst fagdisplay i det nye årtusinde. I: Chem. Rev. (2005), bind 105 (11), s. 4056-72. PMID 16277371 .
  4. ↑ V. B. Rao, L. W. Black: Struktur og samling af bakteriofag T4-hoved. I: Virol J. (2010), bind 7, s. 356. PMID 21129201 ; PMC 3012670 (fri fuldtekst).
  5. ↑ N. Velappan, H. E. Fisher, E. Pesavento, L. Chasteen, S. D'Angelo, C. Kiss, M. Longmire, P. Pavlik, A. R. Bradbury: En omfattende analyse af filamentøse fag-display-vektorer til cytoplasmatiske proteiner: en analyse med forskellige fluorescerende proteiner. I: Nucleic Acids Res . (2010), bind 38 (4), s. E22. PMID 19955231 ; PMC 2831335 (fri fuld tekst).
  6. ↑ J. Speck, K. M. Arndt, K. M. Müller: Effektiv fagvisning af intracellulært foldede proteiner medieret af TAT-vejen. I: Protein Eng Des Sel. (2011), bind 24 (6), s. 473-84. PMID 21289038 . PDF .
  7. ↑ J. Rakonjac, N. J. Bennett, J. Spagnuolo, D. Gagic, M. Russel: filamentøs bakteriofag: biologi, fag-display og nanoteknologi. I: Curr Issues Mol Biol. (2011), bind 13 (2), s. 51-76. PMID 21502666 . PDF .
  8. ↑ B. Braun, M. Paschke: Fag-display på nye måder . I: Biospektrum . 12, nr. 4, 2006, s. 381-383.
  9. ↑ Reto Crameri, Rolf Jaussi, Gunter Menz, Kurt Blaser: Visning af ekspressionsprodukter fra cDNA-biblioteker på fagoverflader . I: European Journal of Biochemistry . bånd 226 , nr. 1 , 1. november 1994, s. 53-58 , doi : 10.1111 / j.1432-1033.1994.00t53.x .
  10. ↑ Sachdev S Sidhu, Wayne J Fairbrother, Kurt Deshayes: Udforskning af protein-protein-interaktioner med fagvisning . I: ChemBioChem . bånd 4 , nr. 1 , 3. januar 2003, s. 14-25 , doi : 10.1002 / cbic.200390008 .

litteratur

  • Thomas Schirrmann, Michael Hust, Stefan Dübel: Antistoffabrikken: Antistoffer til hvert protein . I: Biologi i vores tid . bånd 37 , nr. 6 , 1. december 2007, s. 348–351 , doi : 10.1002 / biuz.200790096 .
  • Hennie R. Hoogenboom: Valg og screening af rekombinante antistofbiblioteker . I: Nature Biotechnology . bånd 23 , nr. 9. september 2005, s. 1105-1116 , doi : 10.1038 / nbt1126 (anmeldelse).
  • A. Schmiedl, S. Dübel: Rekombinante antistoffer og fagvisning i: M. Wink. (Red.): Molekylær bioteknologi. Wiley-VCH. 2004.
  • Valery A Petrenko, Iryna B Sorokulova: Påvisning af biologiske trusler. En udfordring for styret molekylær evolution . I: Journal of Microbiological Methods . bånd 58 , nr. 2. august 2004, s. 147-168 , doi : 10.1016 / j.mimet.2004.04.004 .
  • Peter J. Hudson, Christelle Souriau: Konstruerede antistoffer . I: Naturmedicin . bånd 9 , nr. 1 , 1. januar 2003, s. 129-134 , doi : 10.1038 / nm0103-129 (gennemgang).
  • R. Konterman, S. Dübel: Antibody Engineering - Springer Lab Manual Springer, Heidelberg 2001.
  • F. Breitling, S. Dowel: Rekombinante antistoffer. , Spektrum Akad., Heidelberg 1997.
  • P. Fischer: Ekspression af det humane antistofrepertoire med bakteriofager: Teknikker, applikationer og perspektiver. I: Biospektrum. 2, 1996, s. 26-29 (gennemgang)

Weblinks