Southern blot
Southern blot , Southern hybridisering eller ganske enkelt Southern er en molekylærbiologisk metode , der gør det muligt at påvise tilstedeværelsen af en specifik DNA -sekvens i en kompleks blanding af denne nukleinsyre. Til dette bruger den agarosegelelektroforeseteknikken for at adskille DNA-fragmenterne i henhold til deres længde og senere en overførsel til en membran, hvor hybridiseringen af proben udføres . [ 1 ] Dens navn kommer fra efternavnet på dens opfinder, en engelsk biolog ved navn Edwin Southern .. [ 2 ]
Southern blot-trin
1. DNA-ekstraktion
DNA kan udvindes fra næsten ethvert menneskeligt væv. Mulige kilder til DNA på et gerningssted omfatter blod, sæd, væv fra et dødt offer, hårsækceller og spyt. DNA ekstraheret fra kriminelt bevis ("biologiske spor" eller "spor") sammenlignes med det, der udvindes fra referenceprøver, opnået fra kendte individer, normalt fra blod.
2. Fordøjelse af DNA med en restriktionsendonuklease
DNA'et ekstraheret fra prøven behandles med en restriktionsendonuklease, som er et enzym, der skærer dobbeltstrenget DNA, hvor det har en karakteristisk sekvens. Det enzym, der hyppigst anvendes til lovlig analyse, er HaeIII, som skærer DNA i sekvensen 5'-GGCC-3'.
3. Agarosegelelektroforese
Efter DNA-fordøjelse separeres de resulterende DNA-fragmenter efter deres størrelse ved agarosegelelektroforese. Under elektroforese migrerer DNA-molekyler, som er negativt ladede, mod den positive elektrode. Efterhånden som DNA-molekylerne bevæger sig fremad, bremses deres migrationshastighed af agarosegelmatrixen. Mindre molekyler bevæger sig hurtigere gennem gelporerne end større. Som følge heraf sker der en kontinuerlig adskillelse af DNA-fragmenterne efter deres størrelse, således at de mindste fragmenter rejser den største afstand med reference til prøvens oprindelse eller anvendelsessted.
4. Fremstilling af et Southern-assay ("Southern blot")
Efter elektroforese denatureres de adskilte DNA-molekyler, mens de forbliver på agarosegelen ved at imprægnere den med en alkalisk opløsning. Efter neutraliseringen af dette overføres det resulterende enkeltstrengede DNA til overfladen af en nylonmembran, hvorved der dannes en kopi eller "spor" (den mest bogstavelige oversættelse af det engelske blot, med denne betydning, er "tørrer"). Denne proces med denaturering og overførsel er kendt som Southern-metoden efter dens opfinder, Edward Southern. Ligesom påføring af en blotter på papir med våd blæk overfører en kopi af billedet fra papiret til blotteren, vil "sporing" af DNA'et i gelen på nylonmembranen bevare den rumlige fordeling af DNA-fragmenter opnået i gelen som et resultat. af elektroforese.
5. Hybridisering med radioaktiv sonde
En enkelt-locus-probe er et lille DNA- eller RNA-molekyle, der er i stand til at hybridisere (dvs. danne en DNA-DNA eller DNA-RNA-dupleks) med DNA'et fra et bestemt restriktionsfragment i Southern-assayet. Dannelsen af det dobbeltstrengede molekyle (dupleks) afhænger af parringen af komplementære baser mellem sekvenserne af proben og DNA'et til stede i "sporet". Enkelte locus-prober er sædvanligvis mærket med en radioaktiv isotop for at lette detektionen og vælges til at detektere et polymorft genetisk locus på et enkelt humant kromosom. Southern-assayet, der er et resultat af trin 4, inkuberes i en opløsning indeholdende en enkelt locus radioaktiv probe under betingelser for temperatur og saltkoncentration, der favoriserer hybridisering. Efter dette sker, vaskes den overskydende ubundne probe væk, således at den eneste radioaktivitet, der er tilbage på nylonmembranen, er den, der er forbundet med DNA'et i mållocuset.
6. Påvisning af RFLP'er ved autoradiografi
Hybridiseringspositionerne af den radioaktive probe på Southern blot-membranen påvises ved autoradiografi. I denne teknik placeres nylonmembranen, når den er vasket, ved siden af en røntgenfilm inde i en boks, der isolerer dem fra lys. Filmen registrerer de positioner, hvor der er radioaktivt henfald. Efter eksponering og fotografisk udvikling er den resulterende Southern hybridiseringsrekord kendt som en autoradiografi.
7. Test Southern-resultatet igen med yderligere prober
DNA-polymorfismer på flere forskellige kromosomer karakteriseres ofte i juridisk DNA-analyse. Efter udvikling af en autoradiografi for den første probe kan radioaktiviteten vaskes ud med en højtemperaturopløsning, som efterlader DNA'et på plads, og hybridiseres med en anden radioaktiv probe, der binder til et andet locus. Trin 5-7 gentages således, hver gang det detekteres et andet locus. Gruppen af autoradiografier af det samme Southern blot er kendt som en "DNA-profil".
Molekylær diagnose af sygdomme
Southern Blot er en teknik, der kan give information, der kan bruges til molekylær diagnosticering af nogle genetiske sygdomme, eksempler på dem ville være Angelman Syndrom , Prader-Willi Syndrome og Fragilt X Syndrome . Denne teknik viser sig at være den mest følsomme til diagnosticering af nogle patologier, såsom Angelman-syndrom og Prader-Willi-syndrom. [ 3 ] https://www.aeped.es/sites/default/files/anales/48-6-3.pdf [ 4 ] http://www.cureangelman.org/FASTFaqs/Testing101.pdf ( link brudt tilgængelig på Internet Archive ; se historik , første og sidste version ). Diagnosen består i at udføre en methyleringstest ved hjælp af PCR ved bisulfitbehandling, baseret på DNA ved at studere methyleringen af PW71 locus. En anden sygdom, der også kan diagnosticeres af Southern Blot, er Fragilt X Syndrome. Brugen af denne teknik til denne sygdom vil tillade det nøjagtige antal gentagelser og methyleringer, der forårsager sygdommen, at blive kvantificeret. [ 5 ] http://www.aeped.es/sites/default/files/documentos/sindrome_de_x_fragil.pdf ( brudt link tilgængeligt på Internet Archive ; se historik , første og sidste version ).
Se også
Referencer
- ↑ Griffiths, J.FA et al. (2002). Genetik . McGraw-Hill Interamericana. ISBN 84-486-0368-0 .
- ^ Southern, EM (1975): "Detektion af specifikke sekvenser blandt DNA-fragmenter adskilt ved gelelektroforese", J Mol Biol. , 98:503-517. PMID 1195397
- ↑ Rivas CH, Barabash BA, Gallego MJ, Ramos CC, Osorio CA, Robledo BM, Benitez OJ.(1998): "Hurtig diagnose af Prader-Willi og Angelmans syndrom ved PCR-methyleringstest". An Es Pediatr;48:583-586
- ↑ Sheldon E, Burdine RD. (2011); "Angelman Syndrome: Test 101"
- ^ Molina MPR, Juste JP, Ramos FFJ. (2010); "FRAGILT X SYNDROM". Protokoldiagn ter pediatr;1:85-90.
6. Luis Esteban Noguera University of Nariño MD Southern blot-trin
