Proteinproduktion - Protein production
Proteinproduktion er den bioteknologiske proces til generering af et specifikt protein . Det opnås typisk ved manipulation af genekspression i en organisme, således at den udtrykker store mængder af et rekombinant gen . Dette inkluderer transkription af det rekombinante DNA til messenger- RNA ( mRNA ), translationen af mRNA til polypeptidkæder , som i sidste ende foldes til funktionelle proteiner og kan målrettes mod specifikke subcellulære eller ekstracellulære placeringer.
Proteinproduktionssystemer (i labjargon også kaldet 'ekspressionssystemer') bruges i biovidenskab , bioteknologi og medicin . Molekylærbiologisk forskning bruger adskillige proteiner og enzymer, hvoraf mange stammer fra ekspressionssystemer; især DNA-polymerase til PCR , revers transkriptase til RNA-analyse, restriktionsendonukleaser til kloning og at fremstille proteiner, der screenes i lægemiddelopdagelse som biologiske mål eller som potentielle lægemidler i sig selv. Der er også betydningsfulde anvendelser til ekspressionssystemer i industriel fermentering , især produktion af biofarmaceutiske midler, såsom humant insulin til behandling af diabetes , og til fremstilling af enzymer .
Proteinproduktionssystemer
Almindeligt anvendte proteinproduktionssystemer indbefatter dem, der stammer fra bakterier , gær , baculovirus / insekt , pattedyrceller og for nylig filamentøse svampe, såsom Myceliophthora thermophila . Når biofarmaceutiske produkter produceres med et af disse systemer, ankommer procesrelaterede urenheder kaldet værtscelleproteiner også i slutproduktet i spormængder.
Cellebaserede systemer
De ældste og mest anvendte ekspressionssystemer er cellebaserede og kan defineres som " kombinationen af en ekspressionsvektor , dens klonede DNA og værten for vektoren, der tilvejebringer en kontekst for at tillade fremmed genfunktion i en værtscelle, at er, producere proteiner på et højt niveau ". Overekspression er et unormalt og for højt niveau af genekspression, der producerer en udtalt genrelateret fænotype .
Der er mange måder at introducere fremmed DNA til en celle til ekspression, og mange forskellige værtsceller kan bruges til ekspression - hvert ekspressionssystem har forskellige fordele og forpligtelser. Ekspressionssystemer refereres normalt til af værten og DNA-kilden eller leveringsmekanismen for det genetiske materiale. For eksempel er almindelige værter bakterier (såsom E.coli , B. subtilis ), gær (såsom S.cerevisiae ) eller eukaryote cellelinjer . Almindelige DNA-kilder og leveringsmekanismer er vira (såsom baculovirus , retrovirus , adenovirus ), plasmider , kunstige kromosomer og bakteriofag (såsom lambda ). Det bedste ekspressionssystem afhænger af det involverede gen , for eksempel foretrækkes Saccharomyces cerevisiae ofte for proteiner, der kræver signifikant posttranslational modifikation . Insekt- eller pattedyrscellelinier anvendes, når der kræves human-lignende splejsning af mRNA. Ikke desto mindre har bakterieekspression fordelen ved let at producere store mængder protein, som kræves til røntgenkrystallografi eller nuklear magnetisk resonanseksperimenter til strukturbestemmelse.
Da bakterier er prokaryoter , er de ikke udstyret med det fulde enzymatiske maskineri til at udføre de krævede posttranslationsmodifikationer eller molekylærfoldning. Derfor er eukaryote proteiner med flere domæner udtrykt i bakterier ofte ikke-funktionelle. Også mange proteiner bliver uopløselige som inklusionslegemer, der er vanskelige at komme sig uden barske denatureringsmidler og efterfølgende besværlig protein-genfoldning.
For at imødegå disse bekymringer blev ekspressionssystemer, der bruger flere eukaryote celler, udviklet til applikationer, der kræver, at proteinerne tilpasses som i eller tættere på eukaryote organismer: celler af planter (dvs. tobak), af insekter eller pattedyr (dvs. kvæg) transficeres med gener og dyrket i suspension og endda som væv eller hele organismer for at producere fuldt foldede proteiner. Pattedyrs in vivo ekspressionssystemer har dog lavt udbytte og andre begrænsninger (tidskrævende, toksicitet for værtsceller, ..). For at kombinere de høje udbytter / produktivitet og skalerbare proteinfunktioner hos bakterier og gær og avancerede epigenetiske egenskaber hos planter, insekter og pattedyrssystemer, udvikles andre proteinproduktionssystemer ved hjælp af encellede eukaryoter (dvs. ikke-patogene ' Leishmania ' celler).
Bakterielle systemer
Escherichia coli
E. coli er en af de mest anvendte ekspressionsværter, og DNA introduceres normalt i en plasmidekspressionsvektor . Teknikkerne til overekspression i E. coli er veludviklede og fungerer ved at øge antallet af kopier af genet eller øge bindingsstyrken af promotorregionen, så det hjælper transkription.
For eksempel kunne en DNA-sekvens for et protein af interesse klones eller subklones i et plasmid med højt kopiantal indeholdende lac (ofte LacUV5 ) -promotoren, som derefter transformeres til bakterien E. coli . Tilsætning af IPTG (en lactose- analog) aktiverer lac-promotoren og får bakterierne til at udtrykke proteinet af interesse.
E. coli stamme BL21 og BL21 (DE3) er to stammer, der almindeligvis anvendes til proteinproduktion. Som medlemmer af B-slægten mangler de lon- og OmpT- proteaser og beskytter de producerede proteiner mod nedbrydning. DE3-profagen fundet i BL21 (DE3) tilvejebringer T7 RNA-polymerase (drevet af LacUV5-promotoren), hvilket muliggør anvendelse af vektorer med T7-promotoren i stedet.
Corynebacterium
Ikke-patogene arter af den grampositive Corynebacterium anvendes til kommerciel produktion af forskellige aminosyrer. De C. glutamicum arter er almindeligt anvendt til fremstilling af glutamat og lysin , bestanddele af levnedsmidler, foderstoffer og farmaceutiske produkter.
Ekspression af funktionelt aktiv human epidermal vækstfaktor er blevet udført i C. glutamicum , hvilket viser et potentiale for produktion i industriel skala af humane proteiner. Eksprimerede proteiner kan målrettes mod sekretion gennem enten den generelle, sekretoriske vej (Sec) eller twin-arginin-translokationsvejen (Tat).
I modsætning til gramnegative bakterier mangler de grampositive Corynebacterium lipopolysaccharider, der fungerer som antigene endotoksiner hos mennesker.
Pseudomonas fluorescens
De ikke-patogene og gramnegative bakterier, Pseudomonas fluorescens , anvendes til produktion af højt niveau af rekombinante proteiner; almindeligvis til udvikling af bioterapeutika og vacciner. P. fluorescens er en metabolisk alsidig organisme, der muliggør screening med høj kapacitet og hurtig udvikling af komplekse proteiner. P. fluorescens er mest kendt for sin evne til hurtig og med succes at producere høje titere af aktivt opløseligt protein.
Eukaryote systemer
Gær
Ekspressionssystemer, der anvender enten S. cerevisiae eller Pichia pastoris, tillader stabil og varig produktion af proteiner, der behandles på samme måde som pattedyrceller ved højt udbytte i kemisk definerede medier af proteiner.
Filamentøse svampe
Filamentøse svampe, især Aspergillus og Trichoderma , men også for nylig Myceliophthora thermophila C1 er blevet udviklet til ekspressionsplatforme til screening og produktion af forskellige industrielle enzymer . Ekspressionssystemet Cl viser en morfologi med lav viskositet i nedsænket kultur, hvilket muliggør anvendelse af komplekse vækst- og produktionsmedier.
Baculovirusinficerede celler
Baculovirusinficerede insektceller ( Sf9 , Sf21 , High Five- stammer) eller pattedyrceller ( HeLa , HEK 293 ) tillader produktion af glycosylerede proteiner eller membranproteiner, der ikke kan produceres ved anvendelse af svampe- eller bakteriesystemer. Det er nyttigt til produktion af proteiner i stor mængde. Gener udtrykkes ikke kontinuerligt, fordi inficerede værtsceller til sidst lyserer og dør under hver infektionscyklus.
Ikke-lytisk insektcelleekspression
Ikke-lytisk insektcelleekspression er et alternativ til det lytiske baculovirusekspressionssystem. I ikke-lytisk ekspression transficeres vektorer kortvarigt eller stabilt i det kromosomale DNA fra insektceller til efterfølgende genekspression. Dette efterfølges af selektion og screening af rekombinante kloner. Det ikke-lytiske system er blevet brugt til at give højere proteinudbytte og hurtigere ekspression af rekombinante gener sammenlignet med baculovirus-inficeret celleekspression. Cellelinier anvendt til dette system inkluderer: Sf9 , Sf21 fra Spodoptera frugiperda celler, Hi-5 fra Trichoplusia ni celler og Schneider 2 celler og Schneider 3 celler fra Drosophila melanogaster celler. Med dette system lyserer celler ikke, og flere dyrkningstilstande kan bruges. Derudover er produktion af proteinproduktion reproducerbar. Dette system giver et homogent produkt. En ulempe ved dette system er kravet om et yderligere screeningstrin til valg af levedygtige kloner .
Udgravning
Leishmania tarentolae (kan ikke inficere pattedyr) ekspressionssystemer tillader stabil og varig produktion af proteiner ved højt udbytte i kemisk definerede medier. Producerede proteiner udviser fuldt eukaryote posttranslationsmodifikationer, herunder glycosylering og dannelse af disulfidbinding.
Pattedyrsystemer
De mest almindelige pattedyrsekspressionssystemer er ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) og humane embryonale nyre (HEK) celler.
- Kinesisk hamster ovariecelle
- Muse myelom lymphoblstoid (f.eks NS0 celle)
- Fuldt menneskelig
- Humane embryonale nyreceller ( HEK-293 )
- Humane embryonale retinalceller (Crucells Per.C6)
- Humane fostervandsceller (glykotop og CEVEC)
Cellefrie systemer
Cellefri produktion af proteiner udføres in vitro ved anvendelse af oprenset RNA-polymerase, ribosomer, tRNA og ribonukleotider. Disse reagenser kan produceres ved ekstraktion fra celler eller fra et cellebaseret ekspressionssystem. På grund af de lave ekspressionsniveauer og høje omkostninger ved cellefrie systemer er cellebaserede systemer mere udbredt.
Se også
- Cellosaurus , en database med cellelinjer
- Genekspression
- Enkeltcellet protein
- Proteinoprensning
- Præcisionsgæring
- Værtscelleprotein
- Liste over rekombinante proteiner
Referencer
Yderligere læsning
- Higgins SJ, Hames BD (1999). Proteinekspression: En praktisk tilgang . Oxford University Press. ISBN 978-0-19-963623-5.
- Baneyx, François (2004). Proteinekspressionsteknologier: Nuværende status og fremtidige tendenser . Garland Science. ISBN 978-0-9545232-5-1.
eksterne links
|
Biblioteksressourcer om proteinproduktion |
