Underkloning - Subcloning
I molekylærbiologi er subkloning en teknik, der bruges til at flytte en bestemt DNA-sekvens fra en overordnet vektor til en destinationsvektor .
Underkloning må ikke forveksles med molekylær kloning , en relateret teknik.
Procedure
Restriktionsenzymer bruges til at udskære det interessante gen ( indsatsen ) fra moderen. Indsatsen renses for at isolere det fra andre DNA-molekyler. En almindelig oprensningsmetode er gelisolering . Antallet af kopier af genet amplificeres derefter ved anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR).
Samtidig bruges de samme restriktionsenzymer til at fordøje (skære) destinationen. Ideen bag at bruge de samme restriktionsenzymer er at skabe komplementære klæbrige ender , som letter ligering senere. En phosphatase , almindeligvis kalv-intestinal alkalisk phosphatase (CIAP), tilsættes også for at forhindre selvligering af destinationsvektoren. Den fordøjede destinationsvektor isoleres / oprenses.
Indsatsen og destinationsvektoren blandes derefter sammen med DNA-ligase. Et typisk molforhold mellem insertgener og destinationsvektorer er 3: 1; ved at øge indsatskoncentrationen nedsættes selvligering yderligere. Efter udlejning af reaktionsblandingen sidde i et bestemt tidsrum ved en specifik temperatur (afhængig af størrelsen af strengene bliver ligeret; for mere information se DNA-ligase ), bør indsatsen blive succesfuldt inkorporeres i destinationen plasmidet .
Amplifikation af produktplasmid
Plasmidet transformeres ofte til en bakterie som E. coli . Ideelt set når bakterien deler sig, bør plasmidet også replikeres. I bedste fald skal hver bakteriecelle have flere kopier af plasmidet. Efter at et stort antal bakteriekolonier er vokset, kan de minespræbes for at høste plasmid-DNA'et.
Udvælgelse
For at sikre vækst af kun transformerede bakterier (som bærer de ønskede plasmider, der skal høstes), anvendes et markørgen i destinationsvektoren til selektion . Typiske markørgener er for antibiotikaresistens eller næringsstof biosyntese . Så f.eks. Kunne "markørgenet" være til resistens over for antibiotikumet ampicillin. Hvis bakterierne, der skulle samle det ønskede plasmid, havde samlet det ønskede gen, ville de også indeholde "markørgenet". Nu ville bakterierne, der opsamlede plasmidet, være i stand til at vokse i ampicillin, mens de bakterier, der ikke opsamlede det ønskede plasmid, stadig ville være sårbare over for ødelæggelse af ampicillinet. Derfor ville vellykket transformerede bakterier blive "udvalgt".
Eksempel: bakteriel plasmid-subkloning
I dette eksempel subklones et gen fra pattedyrgenbibliotek i et bakterieplasmid (destinationsplatform). Bakterieplasmidet er et stykke cirkulært DNA, der indeholder regulerende elementer, der tillader bakterierne at producere et genprodukt ( genekspression ), hvis det placeres på det rigtige sted i plasmidet. Produktionsstedet er flankeret af to restriktionsenzymskæringssteder "A" og "B" med uforenelige klæbrige ender.
Pattedyr-DNA'et kommer ikke med disse restriktionssteder, så de er indbygget i PCR med overlapning . Primerne er designet til at anbringe restriktionsstederne omhyggeligt, så kodningen af proteinet er i rammen, og et minimum af ekstra aminosyrer implanteres på hver side af proteinet.
Både PCR-produktet indeholdende pattedyrgenet med de nye restriktionssteder og destinationsplasmidet udsættes for restriktionsfordøjelse, og fordøjelsesprodukterne oprenses ved gelelektroforese .
Fordøjelsesprodukterne, der nu indeholder kompatible klæbrige ender med hinanden (men uforenelige klæbrige ender med sig selv) udsættes for ligering, hvilket skaber et nyt plasmid, der indeholder baggrundselementerne i det originale plasmid med en anden indsats.
Plasmidet transformeres til bakterier, og identiteten af indsatsen bekræftes ved DNA-sekventering .
