Triagem de dois híbridos - Two-hybrid screening

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Visão geral do ensaio de dois híbridos, verificando as interações entre duas proteínas, chamadas aqui de isca e presa .
Um . O gene do fator de transcrição Gal4 produz uma proteína de dois domínios ( BD e AD ) essencial para a transcrição do gene repórter ( LacZ ).
B , C . Duas proteínas de fusão são preparadas: Gal4BD + Bait e Gal4AD + Prey . Nenhum deles é geralmente suficiente para iniciar a transcrição (do gene repórter) sozinho.
D . Quando ambas as proteínas de fusão são produzidas e a parte Bait da primeira proteína de fusão interage com a parte Prey da segunda, ocorre a transcrição do gene repórter.

A triagem de dois híbridos (originalmente conhecido como sistema de dois híbridos de levedura ou Y2H ) é uma técnica de biologia molecular usada para descobrir interações proteína-proteína (PPIs) e proteína-DNA por meio do teste de interações físicas (como ligação) entre duas proteínas ou uma única proteína e uma molécula de DNA , respectivamente.

A premissa por trás do teste é a ativação do (s) gene (s) repórter (s) a jusante pela ligação de um fator de transcrição a uma sequência de ativação a montante (UAS). Para a triagem de dois híbridos, o fator de transcrição é dividido em dois fragmentos separados, chamados de domínio de ligação ao DNA (DBD ou freqüentemente também abreviado como BD) e domínio de ativação (AD). O BD é o domínio responsável pela ligação ao UAS e o AD é o domínio responsável pela ativação da transcrição . O Y2H é, portanto, um ensaio de complementação de fragmento de proteína .

História

Lançada por Stanley Fields e Ok-Kyu Song em 1989, a técnica foi originalmente projetada para detectar interações proteína-proteína usando o ativador transcricional Gal4 da levedura Saccharomyces cerevisiae . A proteína Gal4 ativou a transcrição de um gene envolvido na utilização da galactose, que formou a base da seleção. Desde então, o mesmo princípio foi adaptado para descrever muitos métodos alternativos, incluindo alguns que detectam interações proteína-DNA ou DNA-DNA , bem como métodos que usam diferentes organismos hospedeiros , como Escherichia coli ou células de mamíferos em vez de levedura.

Premissa básica

A chave para a triagem de dois híbridos é que na maioria dos fatores de transcrição eucarióticos , os domínios de ativação e ligação são modulares e podem funcionar próximos um do outro sem ligação direta. Isso significa que, embora o fator de transcrição seja dividido em dois fragmentos, ele ainda pode ativar a transcrição quando os dois fragmentos estiverem indiretamente conectados.

A abordagem de triagem mais comum é o ensaio de dois híbridos de levedura. Nessa abordagem, o pesquisador sabe onde cada presa está localizada no meio utilizado (placas de ágar). Milhões de potenciais interações em vários organismos foram selecionados na última década usando sistemas de triagem de alto rendimento (muitas vezes usando robôs) e mais de milhares de interações foram detectadas e categorizadas em bancos de dados como BioGRID . Este sistema geralmente utiliza uma cepa de levedura geneticamente modificada na qual a biossíntese de certos nutrientes (geralmente aminoácidos ou ácidos nucléicos ) está ausente. Quando cultivada em meios que carecem desses nutrientes, a levedura não sobrevive. Esta cepa de levedura mutante pode ser preparada para incorporar DNA estranho na forma de plasmídeos . Na triagem de dois híbridos de levedura, plasmídeos de isca e presas separados são introduzidos simultaneamente na cepa de levedura mutante ou uma estratégia de acasalamento é usada para obter ambos os plasmídeos em uma célula hospedeira.

A segunda abordagem de alto rendimento é a abordagem de triagem da biblioteca. Nesta configuração, a isca e as células que abrigam a presa são acasaladas em ordem aleatória. Depois de acasalar e selecionar as células sobreviventes em meio seletivo, o cientista irá sequenciar os plasmídeos isolados para ver qual presa (sequência de DNA) está interagindo com a isca usada. Esta abordagem tem uma menor taxa de reprodutibilidade e tende a produzir maiores quantidades de falsos positivos em comparação com a abordagem de matriz.

Os plasmídeos são projetados para produzir um produto de proteína em que o fragmento de domínio de ligação de DNA (BD) é fundido em uma proteína enquanto outro plasmídeo é projetado para produzir um produto de proteína em que o fragmento de domínio de ativação (AD) é fundido em outra proteína. A proteína fundida ao BD pode ser referida como a proteína isca e é tipicamente uma proteína conhecida que o investigador está usando para identificar novos parceiros de ligação. A proteína fundida com a AD pode ser referida como a proteína presa e pode ser uma única proteína conhecida ou uma biblioteca de proteínas conhecidas ou desconhecidas. Neste contexto, uma biblioteca pode consistir em uma coleção de sequências de codificação de proteínas que representam todas as proteínas expressas em um determinado organismo ou tecido, ou pode ser gerada pela síntese de sequências de DNA aleatórias. Independentemente da fonte, eles são subsequentemente incorporados na sequência que codifica a proteína de um plasmídeo, que é então transfectado nas células escolhidas para o método de triagem. Esta técnica, ao usar uma biblioteca, assume que cada célula é transfectada com não mais do que um único plasmídeo e que, portanto, cada célula, em última análise, expressa não mais do que um único membro da biblioteca de proteínas.

Se as proteínas isca e presa interagem (isto é, ligam-se), então o AD e BD do fator de transcrição estão indiretamente conectados, trazendo o AD próximo ao local de início da transcrição e a transcrição do (s) gene (s) repórter pode ocorrer. Se as duas proteínas não interagirem, não haverá transcrição do gene repórter. Desta forma, uma interação bem-sucedida entre a proteína fundida está ligada a uma mudança no fenótipo celular.

O desafio de separar células que expressam proteínas que por acaso interagem com suas proteínas de fusão homólogas daquelas que não o fazem é abordado na seção seguinte.

Domínios fixos

Em qualquer estudo, alguns dos domínios de proteína, aqueles sob investigação, serão variados de acordo com os objetivos do estudo, enquanto outros domínios, aqueles que não estão sendo investigados, serão mantidos constantes. Por exemplo, em um estudo de dois híbridos para selecionar domínios de ligação ao DNA, o domínio de ligação ao DNA, BD, será variado enquanto as duas proteínas interagentes, a isca e a presa, devem ser mantidas constantes para manter uma forte ligação entre o BD e AD. Existem vários domínios para escolher o BD, isca e presa e AD, se quiserem permanecer constantes. Em investigações de interação proteína-proteína, o BD pode ser escolhido a partir de qualquer um dos muitos domínios de ligação de DNA forte, como Zif268 . Uma escolha frequente de domínios de isca e presa são os resíduos 263-352 da levedura Gal11P com uma mutação N342V e os resíduos 58-97 da levedura Gal4, respectivamente. Esses domínios podem ser usados ​​em técnicas de seleção com base em leveduras e bactérias e são conhecidos por se ligarem fortemente.

O AD escolhido deve ser capaz de ativar a transcrição do gene repórter, usando o próprio maquinário de transcrição da célula. Assim, a variedade de ADs disponíveis para uso em técnicas à base de levedura pode não ser adequada para uso em seus análogos à base de bactérias. O AD derivado do vírus herpes simplex, VP16 e levedura Gal4 AD foram usados ​​com sucesso em levedura enquanto uma porção da subunidade α da polimerase de RNA de E. coli foi utilizada em métodos baseados em E. coli .

Embora domínios de ativação poderosa possam permitir maior sensibilidade em relação a interações mais fracas, por outro lado, um AD mais fraco pode fornecer maior rigor.

Construção de plasmídeos de expressão

Uma série de sequências genéticas modificadas devem ser incorporadas à célula hospedeira para realizar a análise de dois híbridos ou uma de suas técnicas derivadas. As considerações e métodos usados ​​na construção e entrega dessas sequências diferem de acordo com as necessidades do ensaio e o organismo escolhido como base experimental.

Existem duas grandes categorias de biblioteca híbrida: bibliotecas aleatórias e bibliotecas baseadas em cDNA. Uma biblioteca de cDNA é constituída pelo cDNA produzido através da transcrição reversa de mRNA coletado de células específicas de tipos de células. Esta biblioteca pode ser ligada a uma construção de modo que seja anexada ao BD ou AD sendo usado no ensaio. Uma biblioteca aleatória usa comprimentos de DNA de sequência aleatória no lugar dessas seções de cDNA. Existem vários métodos para a produção dessas sequências aleatórias, incluindo mutagênese de cassete . Independentemente da fonte da biblioteca de DNA, ela é ligada no local apropriado no plasmídeo / fagemídeo relevante usando as endonucleases de restrição apropriadas .

Considerações específicas de E. coli

Ao colocar as proteínas híbridas sob o controle de promotores lac indutíveis por IPTG , elas são expressas apenas em meio suplementado com IPTG. Além disso, ao incluir diferentes genes de resistência a antibióticos em cada construção genética, o crescimento de células não transformadas é facilmente evitado por meio de cultura em meio contendo os antibióticos correspondentes. Isso é particularmente importante para métodos de contra seleção em que a falta de interação é necessária para a sobrevivência celular.

O gene repórter pode ser inserido no genoma de E. coli inserindo-o primeiro em um epissoma , um tipo de plasmídeo com a capacidade de se incorporar no genoma da célula bacteriana com um número de cópias de aproximadamente um por célula.

Os fagemídeos de expressão híbrida podem ser eletroporados em células E. coli XL-1 Blue que, após amplificação e infecção com fago auxiliar VCS-M13 , produzirão um estoque de fago de biblioteca. Cada um destes fagos conterá um membro de cadeia simples da biblioteca de fagemídeos.

Recuperação de informação de proteína

Uma vez realizada a seleção, deve-se determinar a estrutura primária das proteínas que apresentam as características apropriadas. Isto é conseguido através da recuperação das sequências de codificação de proteínas (como originalmente inseridas) das células que mostram o fenótipo apropriado.

E. coli

O fagemídeo usado para transformar células de E. coli pode ser "resgatado" das células selecionadas infectando-as com o fago auxiliar VCS-M13. As partículas de fago resultantes que são produzidas contêm os fagemídeos de fita simples e são usadas para infectar células XL-1 Blue. Os fagemídeos de fita dupla são subsequentemente coletados dessas células XL-1 Blue, essencialmente revertendo o processo usado para produzir o fago da biblioteca original. Finalmente, as sequências de DNA são determinadas por sequenciamento didesoxi .

Sensibilidade de controle

O repressor Tet-R derivado de Escherichia coli pode ser usado em linha com um gene repórter convencional e pode ser controlado por tetraciclina ou doxiciclina (inibidores de Tet-R). Assim, a expressão de Tet-R é controlada pelo sistema padrão de dois híbridos, mas o Tet-R, por sua vez, controla (reprime) a expressão de um repórter mencionado anteriormente, como HIS3 , por meio de seu promotor Tet-R. A tetraciclina ou seus derivados podem então ser usados ​​para regular a sensibilidade de um sistema que utiliza Tet-R.

A sensibilidade também pode ser controlada variando a dependência das células em seus genes repórter. Por exemplo, isto pode ser afetado pela alteração da concentração de histidina no meio de crescimento para células dependentes de his3 e alteração da concentração de estreptomicina para células dependentes de aadA . A dependência do gene de seleção também pode ser controlada pela aplicação de um inibidor do gene de seleção em uma concentração adequada. 3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT), por exemplo, é um inibidor competitivo do produto do gene HIS3 e pode ser usado para titular o nível mínimo de expressão de HIS3 necessário para o crescimento em meio deficiente em histidina.

A sensibilidade também pode ser modulada pela variação do número de sequências operadoras no DNA repórter.

Proteínas de não fusão

Uma terceira proteína de não fusão pode ser co-expressa com duas proteínas de fusão. Dependendo da investigação, a terceira proteína pode modificar uma das proteínas de fusão ou mediar ou interferir em sua interação.

A co-expressão da terceira proteína pode ser necessária para a modificação ou ativação de uma ou ambas as proteínas de fusão. Por exemplo, S. cerevisiae não possui tirosina quinase endógena. Se uma investigação envolver uma proteína que requer fosforilação da tirosina, a quinase deve ser fornecida na forma de um gene da tirosina quinase.

A proteína de não fusão pode mediar a interação ligando ambas as proteínas de fusão simultaneamente, como no caso da dimerização do receptor dependente de ligante.

Para uma proteína com um parceiro de interação, sua homologia funcional com outras proteínas pode ser avaliada pelo fornecimento da terceira proteína na forma de não fusão, que então pode ou não competir com a proteína de fusão por seu parceiro de ligação. A ligação entre a terceira proteína e a outra proteína de fusão interromperá a formação do complexo de ativação da expressão do repórter e, assim, reduzirá a expressão do repórter, levando à mudança distintiva no fenótipo.

Dois híbridos de levedura de ubiquitina dividida

Uma limitação dos testes clássicos de dois híbridos de levedura é que eles são limitados a proteínas solúveis. Portanto, é impossível usá-los para estudar as interações proteína-proteína entre as proteínas integrais insolúveis da membrana . O sistema de divisão de ubiquitina fornece um método para superar essa limitação. No sistema de divisão de ubiquitina, duas proteínas de membrana integrais a serem estudadas são fundidas a duas frações de ubiquitina diferentes : uma porção de ubiquitina C-terminal ("Cub", resíduos 35-76) e uma porção de ubiquitina N-terminal ("Nub", resíduos 1-34). Essas proteínas fundidas são chamadas de isca e presa, respectivamente. Além de ser fundido a uma proteína de membrana integral, a porção Cub também é fundida a um fator de transcrição (TF) que pode ser clivado por proteases específicas da ubiquitina . Após a interação isca-presa, as porções Nub e Cub se reúnem, reconstituindo a ubiquitina dividida. A molécula de ubiquitina dividida reconstituída é reconhecida por proteases específicas da ubiquitina, que clivam o fator de transcrição, permitindo-lhe induzir a transcrição de genes repórter .

Ensaio fluorescente de dois híbridos

Zolghadr e colaboradores apresentaram um sistema fluorescente de dois híbridos que usa duas proteínas híbridas que são fundidas a diferentes proteínas fluorescentes, bem como LacI, o repressor lac . A estrutura das proteínas de fusão se parece com esta: FP2-LacI-isca e FP1-presa onde a isca e as proteínas de presa interagem e trazem as proteínas fluorescentes (FP1 = GFP , FP2 = mCherry ) em estreita proximidade com o local de ligação do LacI proteína no genoma da célula hospedeira. O sistema também pode ser usado para rastrear inibidores de interações proteína-proteína.

Sistemas enzimáticos de dois híbridos: KISS

Enquanto o sistema Y2H original usava um fator de transcrição reconstituído, outros sistemas criam atividades enzimáticas para detectar PPIs. Por exemplo, o Sensor de substrato KInase ("KISS"), é uma abordagem de dois híbridos de mamíferos que foi projetada para mapear PPIs intracelulares. Aqui, uma proteína isca é fundida a uma porção contendo quinase de TYK2 e uma presa é acoplada a um fragmento de receptor de citocina gp130 . Quando a isca e a presa interagem, o TYK2 fosforila os locais de ancoragem de STAT3 na quimera da presa, o que acaba levando à ativação de um gene repórter .

Variantes híbridas de um, três e um-dois

Um híbrido

A variação de um híbrido desta técnica é projetada para investigar as interações proteína-DNA e usa uma única proteína de fusão na qual o AD está ligado diretamente ao domínio de ligação. O domínio de ligação neste caso, entretanto, não é necessariamente de sequência fixa como na análise de proteína-proteína de dois híbridos, mas pode ser constituído por uma biblioteca. Esta biblioteca pode ser selecionada contra a sequência alvo desejada, que é inserida na região do promotor da construção do gene repórter. Em um sistema de seleção positiva, um domínio de ligação que liga com sucesso o UAS e permite a transcrição é, portanto, selecionado.

Observe que a seleção de domínios de ligação de DNA não é necessariamente realizada usando um sistema de um híbrido, mas também pode ser realizada usando um sistema de dois híbridos em que o domínio de ligação é variado e as proteínas isca e presa são mantidas constantes.

Três híbrido

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Visão geral do ensaio de três híbridos.

As interações RNA-proteína foram investigadas por meio de uma variação de três híbridos da técnica de dois híbridos. Nesse caso, uma molécula de RNA híbrida serve para unir os dois domínios de fusão de proteínas - que não se destinam a interagir um com o outro, mas sim a molécula de RNA intermediária (por meio de seus domínios de ligação de RNA). As técnicas que envolvem proteínas de não fusão que desempenham uma função semelhante, conforme descrito na seção "proteínas de não fusão" acima, também podem ser referidas como métodos de três híbridos.

Um-dois-híbrido

O uso simultâneo dos métodos de um e dois híbridos (ou seja, interação simultânea proteína-proteína e proteína-DNA) é conhecido como uma abordagem um-dois-híbrido e espera-se que aumente o rigor da triagem.

Organismo hospedeiro

Embora teoricamente qualquer célula viva possa ser usada como pano de fundo para uma análise de dois híbridos, há considerações práticas que determinam qual deve ser escolhida. A linha celular escolhida deve ser relativamente barata e fácil de cultivar e suficientemente robusta para resistir à aplicação dos métodos investigativos e reagentes. O último é especialmente importante para fazer estudos de alto rendimento . Portanto, a levedura S. cerevisiae tem sido o principal organismo hospedeiro para estudos de dois híbridos. No entanto, nem sempre é o sistema ideal para estudar proteínas em interação de outros organismos. As células de levedura muitas vezes não têm as mesmas modificações pós-tradução, têm um uso de códon diferente ou carecem de certas proteínas que são importantes para a expressão correta das proteínas. Para lidar com esses problemas, vários novos sistemas de dois híbridos foram desenvolvidos. Dependendo do sistema usado, placas de ágar ou meio de crescimento específico são usados ​​para fazer crescer as células e permitir a seleção para interação. O método mais comumente usado é o de ágar, onde as células são semeadas em meio seletivo para ver se a interação ocorre. As células que não possuem proteínas de interação não devem sobreviver neste meio seletivo.

S. cerevisiae (levedura)

A levedura S. cerevisiae foi o organismo modelo usado durante o início da técnica de dois híbridos. É comumente conhecido como sistema Y2H. Possui várias características que o tornam um organismo robusto para hospedar a interação, incluindo a capacidade de formar estruturas de proteínas terciárias, pH interno neutro, capacidade aprimorada de formar ligações dissulfeto e glutationa em estado reduzido entre outros fatores de tampão citosólicos, para manter um ambiente interno hospitaleiro ambiente. O modelo de levedura pode ser manipulado por meio de técnicas não moleculares e sua seqüência genômica completa é conhecida. Os sistemas de levedura são tolerantes a diversas condições de cultura e produtos químicos agressivos que não poderiam ser aplicados a culturas de tecidos de mamíferos.

Uma série de cepas de levedura foram criadas especificamente para telas Y2H, por exemplo, Y187 e AH109 , ambas produzidas pela Clontech . As cepas de levedura R2HMet e BK100 também foram utilizadas.

Candida albicans

C. albicans é uma levedura com uma característica particular: ela traduz o códon CUG em serina em vez de leucina. Devido a este uso de códon diferente, é difícil usar o sistema modelo S. cerevisiae como um Y2H para verificar as interações proteína-proteína usandogenes de C. albicans . Para fornecer um ambiente mais nativo, foi desenvolvido um sistema de dois híbridos de C. albicans (C2H). Com este sistema, as interações proteína-proteína podem ser estudadas naprópria C. albicans . Uma adição recente foi a criação de um sistema de alto rendimento.

E. coli

Os métodos de dois híbridos bacterianos (B2H ou BTH) são normalmente realizados em E. coli e apresentam algumas vantagens sobre os sistemas baseados em levedura. Por exemplo, a maior eficiência de transformação e taxa de crescimento mais rápida empresta E. coli ao uso de bibliotecas maiores (mais de 10 8 ). A ausência de requisitos para um sinal de localização nuclear a ser incluído na sequência da proteína e a capacidade de estudar proteínas que seriam tóxicas para a levedura também podem ser fatores importantes a serem considerados ao escolher um organismo experimental de fundo.

A atividade de metilação de certas proteínas de DNA metiltransferase de E. coli pode interferir com algumas seleções de proteínas de ligação ao DNA. Se isso for previsto, o uso de uma cepa de E. coli defeituosa para uma metiltransferase específica pode ser uma solução óbvia. O B2H pode não ser ideal ao estudar as interações proteína-proteína eucariótica (por exemplo, proteínas humanas), pois as proteínas podem não se dobrar como nas células eucarióticas ou podem não ter outro processamento.

Células de mamífero

Nos últimos anos, um sistema de dois híbridos de mamífero (M2H) foi projetado para estudar as interações proteína-proteína de mamíferos em um ambiente celular que imita de perto o ambiente de proteína nativa. Células de mamíferos transfectadas transientemente são usadas neste sistema para encontrar interações proteína-proteína. Usar uma linha de células de mamíferos para estudar as interações proteína-proteína de mamíferos dá a vantagem de trabalhar em um contexto mais nativo. As modificações pós-tradução, fosforilação, acilação e glicosilação são semelhantes. A localização intracelular das proteínas também é mais correta em comparação com o uso de um sistema de dois híbridos de levedura. Também é possível com o sistema de dois híbridos de mamíferos estudar as entradas de sinal. Outra grande vantagem é que os resultados podem ser obtidos em até 48 horas após a transfecção.

Arabidopsis thaliana

Em 2005, um sistema de dois híbridos em plantas foi desenvolvido. Usando protoplastos de A. thaliana , as interações proteína-proteína podem ser estudadas em plantas. Desta forma, as interações podem ser estudadas em seu contexto nativo. Neste sistema, o GAL4 AD e o BD estão sob o controle do promotor 35S forte. A interação é medida usando um repórter GUS. Para permitir uma triagem de alto rendimento, os vetores foram tornados compatíveis com o gateway. O sistema é conhecido como sistema de dois híbridos de protoplastos (P2H).

Aplysia californica

A lebre do mar A californica é um organismo modelo em neurobiologia para estudar, entre outros, os mecanismos moleculares da memória de longo prazo. Para estudar interações, importantes em neurologia, em um ambiente mais nativo, um sistema de dois híbridos foi desenvolvido em neurônios de A californica . Um GAL4 AD e BD são usados ​​neste sistema.

Bombyx mori

Um sistema de inseto dois híbrido (I2H) foi desenvolvido em uma linha de células de bicho-da-seda da larva ou lagarta da mariposa da seda domesticada, Bombyx mori (células BmN4). Este sistema usa o GAL4 BD e o domínio de ativação do mouse NF-κB P65. Ambos estão sob o controle do promotor OpIE2.

Formulários

Determinação de sequências cruciais para interação

Alterando aminoácidos específicos por mutação dos pares de bases de DNA correspondentes nos plasmídeos usados, a importância desses resíduos de aminoácidos na manutenção da interação pode ser determinada.

Depois de usar o método baseado em células bacterianas para selecionar proteínas de ligação ao DNA, é necessário verificar a especificidade desses domínios, pois há um limite para a extensão em que o genoma da célula bacteriana pode atuar como um sumidouro para domínios com afinidade para outros sequências (ou, de fato, uma afinidade geral para o DNA).

Descoberta de drogas e venenos

As interações de sinalização proteína-proteína representam alvos terapêuticos adequados devido à sua especificidade e difusão. A abordagem de descoberta aleatória de drogas usa bancos de compostos que compreendem estruturas químicas aleatórias e requer um método de alto rendimento para testar essas estruturas em seu alvo pretendido.

A célula escolhida para a investigação pode ser especificamente projetada para espelhar o aspecto molecular que o investigador pretende estudar e, em seguida, usada para identificar novos agentes terapêuticos ou anti-pragas para humanos ou animais.

Determinação da função da proteína

Por determinação dos parceiros de interação de proteínas desconhecidas, as possíveis funções dessas novas proteínas podem ser inferidas. Isso pode ser feito usando uma única proteína conhecida contra uma biblioteca de proteínas desconhecidas ou, inversamente, selecionando a partir de uma biblioteca de proteínas conhecidas usando uma única proteína de função desconhecida.

Seleção de proteína de dedo de zinco

Para selecionar proteínas de dedo de zinco (ZFPs) para engenharia de proteínas , métodos adaptados da técnica de triagem de dois híbridos foram usados ​​com sucesso. A ZFP é ela própria uma proteína de ligação ao DNA usada na construção de domínios de ligação ao DNA personalizados que se ligam a uma sequência de DNA desejada.

Usando um gene de seleção com a sequência alvo desejada incluída no UAS, e randomizando as sequências de aminoácidos relevantes para produzir uma biblioteca ZFP, as células que hospedam uma interação DNA-ZFP com as características necessárias podem ser selecionadas. Cada ZFP normalmente reconhece apenas 3-4 pares de bases, então para evitar o reconhecimento de sites fora do UAS, o ZFP randomizado é projetado em um 'andaime' consistindo em outros dois ZFPs de sequência constante. O UAS é, portanto, projetado para incluir a sequência alvo do andaime constante, além da sequência para a qual um ZFP é selecionado.

Vários outros domínios de ligação ao DNA também podem ser investigados usando este sistema.

Forças

  • Telas de dois híbridos são de baixa tecnologia; eles podem ser realizados em qualquer laboratório sem equipamentos sofisticados.
  • As telas de dois híbridos podem fornecer uma primeira dica importante para a identificação de parceiros de interação.
  • O ensaio é escalonável, o que torna possível rastrear as interações entre muitas proteínas. Além disso, pode ser automatizado e, com o uso de robôs, muitas proteínas podem ser selecionadas contra milhares de proteínas potencialmente interagentes em um tempo relativamente curto. Dois tipos de telas grandes são usados: a abordagem de biblioteca e a abordagem de matriz.
  • Os dados de dois híbridos de levedura podem ser de qualidade semelhante aos dados gerados pela abordagem alternativa de purificação por coafinidade seguida por espectrometria de massa (AP / MS).

Fraquezas

  • A principal crítica aplicada à triagem de dois híbridos de levedura das interações proteína-proteína é a possibilidade de um alto número de identificações falso-positivas (e falso-negativas). A taxa exata de resultados falsos positivos não é conhecida, mas as estimativas anteriores chegavam a 70%. Isso também, em parte, explica a sobreposição muito pequena frequentemente encontrada nos resultados ao usar uma triagem de dois híbridos (alto rendimento), especialmente ao usar sistemas experimentais diferentes.

A razão para essa alta taxa de erro está nas características da tela:

  • Certas variantes do ensaio superexpressam as proteínas de fusão, o que pode causar concentrações de proteínas não naturais que levam a positivos inespecíficos (falsos).
  • As proteínas híbridas são proteínas de fusão; isto é, as partes fundidas podem inibir certas interações, especialmente se uma interação ocorrer no terminal N de uma proteína de teste (onde o domínio de ligação ou ativação de DNA está tipicamente ligado).
  • Uma interação pode não acontecer na levedura, o organismo hospedeiro típico do Y2H. Por exemplo, se uma proteína bacteriana é testada em levedura, pode faltar um acompanhante para o dobramento adequado que está presente apenas em seu hospedeiro bacteriano. Além disso, uma proteína de mamífero às vezes não é modificada corretamente na levedura (por exemplo, falta de fosforilação ), o que também pode levar a resultados falsos.
  • O Y2H ocorre no núcleo. Se as proteínas de teste não estiverem localizadas no núcleo (porque têm outros sinais de localização), duas proteínas interagentes podem ser consideradas não-interagentes.
  • Algumas proteínas podem interagir especificamente quando são coexpressas na levedura, embora na realidade nunca estejam presentes na mesma célula ao mesmo tempo. No entanto, na maioria dos casos, não se pode excluir que tais proteínas sejam de fato expressas em certas células ou em certas circunstâncias.

Cada um desses pontos por si só pode dar origem a resultados falsos. Devido aos efeitos combinados de todas as fontes de erro, os dois híbridos de levedura devem ser interpretados com cautela. A probabilidade de gerar falsos positivos significa que todas as interações devem ser confirmadas por um ensaio de alta confiança, por exemplo, co-imunoprecipitação das proteínas endógenas, o que é difícil para dados de interação proteína-proteína em grande escala. Alternativamente, os dados Y2H podem ser verificados usando múltiplas variantes Y2H ou técnicas de bioinformática. O último testa se proteínas interagentes são expressas ao mesmo tempo, compartilham algumas características comuns (como anotações de ontologia de genes ou certas topologias de rede ), têm interações homólogas em outras espécies.

Veja também

  • Phage display , um método alternativo para detectar interações proteína-proteína e proteína-DNA
  • Matriz de proteínas , um método baseado em chip para detectar interações proteína-proteína
  • Análise de matriz genética sintética , um método baseado em levedura para estudar interações de genes

Referências

links externos

Recursos de biblioteca sobre
a triagem de dois híbridos