Maxam - Gilbert sekvensering - Maxam–Gilbert sequencing
Maxam - Gilbert sekvensering er en metode for DNA -sekvensering utviklet av Allan Maxam og Walter Gilbert i 1976–1977. Denne metoden er basert på nukleobase -spesifikk delvis kjemisk modifikasjon av DNA og påfølgende spaltning av DNA -ryggraden på steder ved siden av de modifiserte nukleotidene .
Maxam - Gilbert sekvensering var den første allment brukte metoden for DNA -sekvensering, og representerer sammen med Sanger dideoxy -metoden den første generasjonen av DNA -sekvenseringsmetoder. Maxam-Gilbert sekvensering er ikke lenger i utbredt bruk, etter å ha blitt erstattet av neste generasjons sekvenseringsmetoder .
Historie
Selv om Maxam og Gilbert publiserte sin kjemiske sekvenseringsmetode to år etter at Frederick Sanger og Alan Coulson publiserte arbeidet med pluss-minus sekvensering, ble Maxam-Gilbert sekvensering raskt mer populær, siden renset DNA kunne brukes direkte, mens den første Sanger-metoden krevde at hver lesestart klones for produksjon av enkeltstrenget DNA. Imidlertid, med forbedringen av kjedeavslutningsmetoden (se nedenfor), har Maxam-Gilbert-sekvensering falt i unåde på grunn av dens tekniske kompleksitet som forbyr bruk i standard molekylærbiologiske sett, omfattende bruk av farlige kjemikalier og problemer med skala- opp.
Allan Maxam og Walter Gilberts papir fra 1977 "En ny metode for sekvensering av DNA" ble hedret med en Citation for Chemical Breakthrough Award fra Division of History of Chemistry of the American Chemical Society for 2017. Den ble presentert for Institutt for molekylær og cellulær biologi , Harvard University.
Fremgangsmåte
Maxam- Gilbert sekvensering krever radioaktiv merking i en 5 'ende av DNA-fragmentet som skal sekvenseres (vanligvis ved en kinasereaksjon ved bruk av gamma- 32 P ATP ) og rensing av DNA. Kjemisk behandling genererer brudd i en liten andel av en eller to av de fire nukleotidbasene i hver av fire reaksjoner (G, A+G, C, C+T). For eksempel, puriner er (a + G) depurinated ved hjelp av maursyre , den guaniner (og til en viss grad adeniner ) blir denaturert ved dimetylsulfat , og pyrimidiner (C + T) blir hydrolysert under anvendelse av hydrazin . Tilsetning av salt ( natriumklorid ) til hydrazinreaksjonen hemmer reaksjonen av tymin for C-reaksjonen. De modifiserte DNA -ene kan deretter spaltes av varmt piperidin ; (CH 2 ) 5 NH i posisjonen til den modifiserte basen. Konsentrasjonen av de modifiserende kjemikaliene kontrolleres for å innføre i gjennomsnitt en modifikasjon per DNA -molekyl. Dermed genereres en serie merkede fragmenter, fra den radiomerkede enden til det første "kutt" -stedet i hvert molekyl.
Fragmentene i de fire reaksjonene blir elektroforesert side om side i denaturerende akrylamidgeler for størrelsesseparasjon. For å visualisere fragmentene blir gelen utsatt for røntgenfilm for autoradiografi , noe som gir en serie mørke bånd som hver viser plasseringen av identiske radiomerkede DNA-molekyler. Fra nærvær og fravær av visse fragmenter kan sekvensen utledes.
Relaterte metoder
Denne metoden førte til Methylation Interference Assay, som ble brukt til å kartlegge DNA-bindingssteder for DNA-bindende proteiner .
En automatisert Maxam - Gilbert sekvenseringsprotokoll ble utviklet i 1994.
