RecBCD - RecBCD

Esodesossiribonucleasi V
Figura 1 La struttura cristallografica dell'enzima RecBCD ( PDB : 1W36 ). Le subunità RecB, RecC e RecD dell'enzima sono colorate rispettivamente di ciano, verde e magenta mentre l'elica del DNA parzialmente svolta a cui è legato l'enzima è di colore marrone.
Identificatori
CE n.	3.1.11.5
CAS n.	37350-26-8
Banche dati
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BRENDA	Ingresso BRENDA
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RecBCD ( CE 3.1.11.5 , esonucleasi V , Escherichia coli esonucleasi V , E. coli esonucleasi V , gene recBC endoenzyme , RecBC deossiribonucleasi , gene recBC DNasi , gene recBCD enzimi ) è un enzima di E. coli batterio che iniziati recombinational riparazione da rotture del doppio filamento potenzialmente letali nel DNA che possono derivare da radiazioni ionizzanti , errori di replicazione, endonucleasi , danno ossidativo e una miriade di altri fattori. L'enzima RecBCD è sia un'elicasi che svolge o separa i filamenti di DNA, sia una nucleasi che crea scheggiature a filamento singolo nel DNA.

Struttura

Il complesso enzimatico è composto da tre diverse subunità chiamate RecB, RecC e RecD e quindi il complesso è chiamato RecBCD (Figura 1). Prima della scoperta del gene recD , l'enzima era noto come "RecBC". Ogni subunità è codificata da un gene separato:

Funzione

Figura 2 Percorso RecBCD della ricombinazione omologa in cui l'ATP è in eccesso.

Sia la subunità RecD che RecB sono elicasi, cioè motori molecolari dipendenti dall'energia che svolgono il DNA (o RNA nel caso di altre proteine). La subunità RecB ha inoltre una funzione nucleasica. Infine, l'enzima RecBCD (forse la subunità RecC) riconosce una sequenza specifica nel DNA, 5' -GCTGGTGG- 3' , nota come Chi (a volte indicata con la lettera greca χ).

RecBCD è insolito tra le elicasi perché ha due elicasi che viaggiano con velocità diverse e perché può riconoscere ed essere alterata dalla sequenza del DNA Chi. RecBCD lega avidamente un'estremità del DNA lineare a doppia elica (ds). L'elicasi RecD viaggia sul filamento con un'estremità 5' in corrispondenza della quale l'enzima inizia lo svolgimento e RecB sul filamento con un'estremità 3'. RecB è più lento di RecD, quindi un loop di DNA a filamento singolo (ss) si accumula prima di RecB (Figura 2). Questo produce strutture di DNA con due code ss (una coda con estremità 3' più corta e una coda con estremità 5' più lunga) e un ciclo ss (sul filamento con estremità 3') osservate al microscopio elettronico. Le code ss possono ricottura per produrre un secondo ciclo ss complementare al primo; tali strutture a doppio anello erano inizialmente chiamate "orecchie di coniglio".

Meccanismo di azione

Figura 3 Inizio della via RecBCD di ricombinazione omologa in cui Mg ²⁺ è in eccesso.

Durante lo svolgimento la nucleasi in RecB può agire in modi diversi a seconda delle condizioni di reazione, in particolare il rapporto tra le concentrazioni di ioni Mg ²⁺ e ATP. (1) Se l'ATP è in eccesso, l'enzima intacca semplicemente il filamento con Chi (il filamento con l'estremità iniziale 3') (Figura 2). Lo svolgimento continua e produce una coda di 3' ss con Chi vicino al suo capolinea. Questa coda può essere legata dalla proteina RecA, che promuove lo scambio di filamenti con un duplex di DNA omologo intatto. Quando RecBCD raggiunge la fine del DNA, tutte e tre le subunità si disassemblano e l'enzima rimane inattivo per un'ora o più; una molecola RecBCD che ha agito su Chi non attacca un'altra molecola di DNA. (2) Se gli ioni Mg ²⁺ sono in eccesso, RecBCD scinde entrambi i filamenti di DNA in modo endonucleolitico, sebbene la coda 5' venga tagliata meno spesso (Figura 3). Quando RecBCD incontra un sito Chi sul filamento con estremità 3', le pause di svolgimento e la digestione della coda 3' sono ridotte. Quando RecBCD riprende a svolgersi, ora taglia il filamento opposto ( cioè la coda 5') e carica la proteina RecA sul filamento con estremità 3'. Dopo aver completato la reazione su una molecola di DNA, l'enzima attacca rapidamente un secondo DNA, sul quale si verificano le stesse reazioni del primo DNA.

Sebbene nessuna reazione sia stata verificata dall'analisi del DNA intracellulare, a causa della natura transitoria degli intermedi di reazione, l'evidenza genetica indica che la prima reazione imita più da vicino quella nelle cellule. Ad esempio, l'attività del Chi è influenzata dai nucleotidi al suo lato 3', sia nelle cellule che nelle reazioni con ATP in eccesso ma non con Mg ²⁺ in eccesso [PMIDs 27401752, 27330137]. I mutanti RecBCD privi di attività esonucleasica rilevabile mantengono un'elevata attività di hotspot Chi nelle cellule e intaccano la Chi all'esterno delle cellule. Un sito Chi su una molecola di DNA nelle cellule riduce o elimina l'attività Chi su un altro DNA, forse riflettendo il disassemblaggio Chi-dipendente di RecBCD osservato in vitro in condizioni di eccesso di ATP e intaccamento del DNA a Chi.

In entrambe le condizioni di reazione, il filamento 3' rimane intatto a valle del Chi. La proteina RecA viene quindi caricata attivamente sulla coda 3' da RecBCD. Ad un certo punto indeterminato RecBCD si dissocia dal DNA, sebbene RecBCD possa svolgere almeno 60 kb di DNA senza cadere. RecA avvia lo scambio del filamento di DNA a cui è legato con il filamento identico, o quasi identico, in un duplex di DNA intatto; questo scambio di filamenti genera una molecola di DNA articolare, come un D-loop (Figura 2). Si pensa che la molecola di DNA articolare venga risolta o mediante replicazione innescata dall'invasione del filamento con estremità 3' contenente Chi o mediante scissione dell'ansa D e formazione di una giunzione Holliday. La giunzione Holliday può essere risolta in DNA lineare dal complesso RuvABC o dissociata dalla proteina RecG . Ciascuno di questi eventi può generare DNA intatto con nuove combinazioni di marcatori genetici in base ai quali i DNA parentali possono differire. Questo processo, ricombinazione omologa , completa la riparazione della rottura del DNA a doppio filamento.

Applicazioni

RecBCD è un enzima modello per l'uso della fluorescenza a singola molecola come tecnica sperimentale utilizzata per comprendere meglio la funzione delle interazioni proteina-DNA. L'enzima è anche utile nella rimozione del DNA lineare, a singolo o doppio filamento, da preparazioni di DNA circolare a doppio filamento, poiché richiede un'estremità del DNA per l'attività.

Riferimenti

link esterno

• Exodeoxyribonuclease+V presso la National Library of Medicine degli Stati Uniti Medical Subject Headings (MeSH)
• Exodeoxyribonuclease+V,+E+coli presso la Biblioteca Nazionale degli Stati Uniti di Medicina Medical Subject Headings (MeSH)
• CE 3.1.11.5