Cap analisi dell'espressione genica - Cap analysis gene expression

Cap analysis gene expression ( CAGE ) è una tecnica di espressione genica utilizzata in biologia molecolare per produrre un'istantanea dell'estremità 5' della popolazione di RNA messaggero in un campione biologico (il trascrittoma ). I piccoli frammenti (storicamente lunghi 27 nucleotidi , ma ora limitati solo dalle tecnologie di sequenziamento) dall'inizio degli mRNA (estremità 5' dei trascritti chiusi ) vengono estratti, retrotrascritti a DNA, amplificati con PCR e sequenziati . CAGE è stato pubblicato per la prima volta da Hayashizaki, Carninci e collaboratori nel 2003. CAGE è stato ampiamente utilizzato all'interno dei progetti di ricerca FANTOM .

Analisi

L'output di CAGE è un insieme di brevi sequenze nucleotidiche (spesso chiamate tag ) con i loro conteggi osservati.

Utilizzando un genoma di riferimento, un ricercatore di solito può determinare, con una certa sicurezza, l' mRNA originale (e quindi da quale gene ) è stato estratto il tag.

Il numero di copie dei tag CAGE fornisce un modo semplice di quantificazione digitale delle abbondanze del trascritto di RNA nei campioni biologici.

A differenza di una tecnica simile per l' analisi seriale dell'espressione genica (SAGE, superSAGE) in cui i tag provengono da altre parti delle trascrizioni, CAGE viene utilizzata principalmente per individuare i siti di inizio della trascrizione esatti nel genoma. Questa conoscenza a sua volta consente a un ricercatore di studiare la struttura del promotore necessaria per l'espressione genica.

Tuttavia, il protocollo CAGE ha un pregiudizio noto con una guanina non specifica (G) al massimo 5 'estremità dei tag CAGE, che è attribuita all'estensione 5' senza modello durante la sintesi del cDNA del primo filamento . Ciò indurrebbe una mappatura errata dei tag CAGE, ad esempio su pseudogeni non trascritti. D'altra parte, questa aggiunta di Gs è stata utilizzata anche come segnale per filtrare picchi TSS più affidabili.

Storia

Il metodo CAGE originale (Shiraki et al. , 2003) utilizzava CAP Trapper per catturare le estremità 5′, primer oligo-dT per sintetizzare i cDNA, l' enzima di restrizione di tipo II MmeI per scindere i tag e il metodo Sanger per sequenziarli .

I primer a trascrizione inversa casuale sono stati introdotti nel 2006 da Kodzius et al. per rilevare meglio gli RNA non poliadenilati.

In DeepCAGE (Valen et al. , 2008), i concatenatori di tag sono stati sequenziati a un throughput più elevato sulla piattaforma di sequenziamento 454 "di prossima generazione ".

Nel 2008, il multiplexing di codici a barre è stato aggiunto al protocollo DeepCAGE (Maeda et al. , 2008).

In nanoCAGE (Plessy et al. , 2010), le estremità 5' o RNA sono state catturate con il metodo di commutazione del modello invece di CAP Trapper, al fine di analizzare quantità iniziali più piccole di RNA totale. I tag più lunghi sono stati scissi con l' enzima di restrizione di tipo III EcoP15I e sequenziati direttamente sulla piattaforma Solexa (poi Illumina) senza concatenazione.

La metodologia CAGEscan (Plessy et al. , 2010), in cui viene saltata la scissione del tag enzimatico e il paired-end sequenziato di 5′ cDNA , è stata introdotta nello stesso articolo per collegare nuovi promotori ad annotazioni note.

Con HeliScopeCAGE (Kanamori-Katayama et al. , 2011), il protocollo CAGE con trappola CAP è stato modificato per saltare la scissione del tag enzimatico e sequenziare direttamente le estremità 5' tappate sulla piattaforma HeliScope , senza amplificazione PCR. È stato poi automatizzato da Itoh et al. nel 2012.

Nel 2012 il protocollo CAGE standard è stato aggiornato da Takahashi et al. per tagliare i tag con EcoP15I e metterli in sequenza sulla piattaforma Illumina-Solexa.

Nel 2013, Batut et al. trapper CAP combinato, commutazione del modello e digestione con esonucleasi 5′-fosfato-dipendente in RAMPAGE per massimizzare la specificità del promotore.

Nel 2014 Murata et al. ha pubblicato il protocollo nAnTi-CAGE , in cui le estremità 5' tappate vengono sequenziate sulla piattaforma Illumina senza amplificazione PCR e senza scissione del tag.

Nel 2017, Poulain et al. aggiornato il protocollo nanoCAGE per utilizzare il metodo di tagmentazione (basato sulla trasposizione Tn5 ) per il multiplexing.

Nel 2018, Cvetesic et al. ha aumentato la sensibilità della CAGE intrappolata da CAP introducendo un carrier RNA selettivamente degradabile (SLIC-CAGE, "Super-Low Input Carrier-CAGE").

Nel 2021, Takahashi et al. ha semplificato il sequenziamento delle librerie CAGE sui sequenziatori Illumina saltando la sintesi del secondo filamento caricando direttamente cDNA a filamento singolo (Low Quantity Single Strand CAGE, "LQ-ssCAGE").

Guarda anche

Riferimenti

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