4Pi mikroszkóp - 4Pi microscope
A 4Pi mikroszkóp lézerpásztázó fluoreszcens mikroszkóp , javított tengelyirányú felbontással . Ezzel az 500–700 nm tengelyirányú felbontás tipikus tartománya 100–150 nm -re javítható, ami majdnem gömb alakú fókuszfoltnak felel meg, 5-7 -szer kisebb térfogattal, mint a standard konfokális mikroszkópia .
Működési elv
A felbontás javulását két ellentétes objektív használatával érik el, amelyek mindkettő ugyanarra a geometriai helyre vannak fókuszálva. Ezenkívül a két objektív lencséjének optikai útvonalának különbsége is gondosan igazodik, hogy minimális legyen. Ezzel a módszerrel mindkét objektum közös fókuszterületén található molekulák koherensen megvilágíthatók mindkét oldalról, és a visszavert vagy kibocsátott fény is koherensen összegyűjthető, azaz lehetséges a kibocsátott fény koherens szuperpozíciója az érzékelőn. A megvilágításhoz és érzékeléshez használt szilárd szög növekszik, és megközelíti a maximumot. Ebben az esetben a minta egyszerre világít és minden oldalról észlelhető.
A 4Pi mikroszkóp működési módja az ábrán látható. A lézerfényt egy sugárosztó osztja fel, és tükrök irányítják a két ellentétes objektív felé. A közös fókuszpontban mindkét fókuszált fénysugár szuperpozíciója történik. Az izgatott molekulák ezen a helyzeten fluoreszcens fényt bocsátanak ki, amelyet mindkét objektív összegyűjt, ugyanaz a nyalábosztó kombinál, és dikroikus tükörrel detektorra tereli. Mindkét kibocsátott fényút szuperpozíciója ismét megtörténhet.
Ideális esetben minden objektív objektív képes szögből fényt gyűjteni . Két objektívvel minden irányból (tömör szög ) lehet gyűjteni . Az ilyen típusú mikroszkópia elnevezése a gerjesztés és észlelés lehetséges maximális szögéből származik. Gyakorlatilag csak körülbelül 140 ° -os rekesznyílás -szöget lehet elérni egy objektívlencse esetében, ami megfelel .
A mikroszkóp háromféleképpen működtethető: Az A típusú 4Pi mikroszkópban a gerjesztő fény koherens szuperpozícióját használják a megnövelt felbontás létrehozásához. Az emissziós fényt csak az egyik oldalról észlelik, vagy mindkét oldalról inkoherens szuperpozícióban. A B típusú 4Pi mikroszkópban csak az emissziós fény zavar. C típusú üzemmódban történő működtetés esetén a gerjesztő és az emissziós fény egyaránt zavarhatja, ami a lehető legnagyobb felbontásnövekedést eredményezi (~ 7-szerese az optikai tengely mentén a konfokális mikroszkópiához képest).
Egy valódi 4Pi mikroszkóp fényét nem lehet minden irányból egyenlően alkalmazni vagy összegyűjteni, ami úgynevezett oldalsó lebenyekhez vezet a pontszórási funkcióban . Jellemzően (de nem mindig) kétfoton gerjesztési mikroszkópiát használnak 4Pi mikroszkópban emissziós tűlyukkal kombinálva, hogy ezeket az oldalsó lebenyeket tűrhető szintre süllyesszék.
Történelem
1971-ben Christoph Cremer és Thomas Cremer egy tökéletes hologram létrehozását javasolta , vagyis azt, amely minden pontirányban hordozza a pontforrás kibocsátásának teljes terepi információját, az úgynevezett hologramot. Az 1978-as publikáció azonban helytelen fizikai következtetést vonott le (azaz egy pontszerű fényfoltot), és teljesen kihagyta az axiális felbontás növekedését, mivel az a tényleges előny, hogy hozzáadja a szög másik oldalát. A 4Pi mikroszkópia megvalósítható rendszerének első leírását, azaz a két ellentétes, zavaró lencsével való összeállítást Stefan Hell találta ki 1991 -ben. Ezt kísérletileg 1994 -ben bizonyította.
A következő években nőtt a mikroszkóp alkalmazásainak száma. Például a párhuzamos gerjesztés és észlelés 64 foltot tartalmaz a mintában egyidejűleg a javított térbeli felbontással, ami a mitokondriumok dinamikájának sikeres rögzítését eredményezte élesztősejtekben 4Pi mikroszkóppal 2002 -ben. A kereskedelmi verziót a Leica Microsystems mikroszkópgyártó dobta piacra 2004 -ben, majd később megszűnt.
Eddig a 4Pi mikroszkóp legjobb minőségét olyan szuperfelbontási technikákkal együtt érték el, mint a stimulált emisszió-kimerülés (STED) elv. A 4Pi mikroszkóp segítségével, megfelelő gerjesztő és gerjesztő sugárzással egységesen 50 nm méretű foltot lehetett létrehozni, ami a konfokális mikroszkópiához képest 150–200-szoros mértékben csökkent fókusztérfogatnak felel meg a rögzített sejtekben. A 4Pi mikroszkópia és a RESOLFT mikroszkópia és a kapcsolható fehérjék kombinációjával mostantól lehetőség van élő sejtek felvételére alacsony fényviszonyok mellett, 40 nm alatti izotróp felbontással.
