Sortase

A szortáz C a B csoport streptococcusaiból

A szortázok membránnal társult bakteriális enzimek családját alkotják, és a transzpeptidázok osztályába vannak besorolva .

jellemzők

A szortázok biológiai funkciója a kiválasztott fehérjék kovalens lehorgonyozása a gram-pozitív baktériumok peptidoglikán rétegében . Ezenkívül vannak szortázok, amelyek felelősek az egyedileg expresszált fehérje alegységekből kialakuló pilusszerkezetek felépítéséért . Ezért a szortázok nagy mértékben felelősek a gram-pozitív baktériumok sejtfelszínének szerkezetéért.

Mivel a baktériumok felszínén számos virulenciafaktor található, a fertőzéses megbetegedések kezelésében lehetséges terápiás célpontként tárgyalják a szortázokat .

A szortáz reakciómechanizmus in vitro felhasználható a fehérjék (beleértve más molekulákat is) kovalens és helyspecifikus összekapcsolására, ezért az enzimeket a biotechnológiában is használják. Előnyös itt, hogy a funkcionális szortázok heterológ módon expresszálhatók (például E. coli-ban ), ami viszonylag kevés erőfeszítéssel nagyobb méretben történő termelést tesz lehetővé.

A szortázokhoz kétértékű kationok (pl. Ca ²⁺ ) szükségesek kofaktorként .

Előfordulás és osztályozás

Sortases megtalálhatók szinte az összes Gram-pozitív baktériumok, de szintén megtalálható elszigetelt eseteiben Gram-negatív és archaea . A mai napig több mint 260 különböző fajban több mint 800 gént azonosítottak, amelyek a szortázzal kapcsolatos fehérjéket kódolják. Ezeknek a fehérjéknek mintegy 60% -a felosztható összesen hat különböző csoportba (A - F).

Az egyes csoportokat funkciójuk és szubsztrát-specifitásuk szerint különböztetjük meg . Míg az A és B csoportnak elsősorban a fehérjék horgonyzása a baktériumok peptidoglikán rétegében, addig a C és D csoport szortázai részt vesznek a pólusszerkezetek felépítésében. Továbbá, a D csoport sortases gyakran megtalálhatók nemzetségbe tartozó baktériumok Bacillus , amelyben vannak társítva a kialakulását endospórák . Az E és F sortázok funkciói még nem teljesen értettek.

Általános szabály, hogy a gram-pozitív baktériumok többféle szortázzal rendelkeznek.

A reakció mechanizmusa

Két fehérje összekapcsolása A sortázzal: első lépésben a sortáz elvágja az LPXTG motívumot, és kialakul egy átmeneti állapot (1) . Ez az átmeneti állapot ezután egy másik fehérje szabad glicin maradékával reagál (2) . A szortáz kovalensen összeköti a két fehérjét, ezáltal helyreállítja az LPXTG motívumot (3)

Az A sortáz funkciója a S. aureus-ban . A felszíni fehérje transzportálódik az extracelluláris térbe (a) , és kapcsolódik a sejtmembrán (b) . Ezután a fehérje kovalensen kapcsolódik egy sejtfal-komponenshez (lipid II) az A sortáz (c) segítségével, és így a peptidoglikán réteg (d) része.

Alapvetően a szortázok képesek két peptidmaradékot kovalensen összekapcsolni egymással. Ehhez szükségük van egy speciális felismerési motívumra, amely gyakran öt aminosavból áll . A szortázok feloszthatják ezeket a felismerési motívumokat egy fehérjében, majd újra összeállíthatják őket egy másik ligandummal. Az azonosítási motívumok a szortáz és az organizmus típusától függően eltérőek lehetnek.

In vitro reakció

A következő részben a szortáz reakció mechanizmusát szemléltetjük a Staphylococcus aureus jól jellemzett A szar-zázának felhasználásával . Ennek a szortáznak a felismerési motívuma az LPXTG (leucin-prolin-Xaa-treonin-glicin). X jelentése bármely aminosav.

A reakció két lépésben megy végbe. Először a Sortase A kötődik a fehérjéhez / peptidhez. A kovalens kötés között zajlik a tiol maradékot egy cisztein a aktív centrumában a szortáz A és a treonin belül LPXTG felismerő szekvencia. Ennek eredményeként a fehérje C-terminális maradéka, beleértve a glicint , szétválik. Olyan átmeneti állapot lép fel, amelyben az A-sortáz kovalensen kapcsolódik a fehérje-maradékhoz. A második lépésben ez az átmeneti állapot egy szabad, N-terminális glicinmaradékkal rendelkező fehérjével / peptiddel találkozik. A két fehérje kovalensen kapcsolódik egymáshoz az A sortáz segítségével, amely helyreállítja az eredeti peptidkötést (az LPXTG motívumot).

A Staphylococcus aureus- ból származó A-sortáz in vivo funkciója

A S. aureus sejtfalába beépíteni kívánt fehérjéknek több funkcionális alegységük van. Ez magában foglal egy N- terminális szignálpeptidet (SP), amely felelős annak biztosításáért, hogy a fehérje a citoplazmából - a membránon keresztül - az extracelluláris térbe szekretálódjon. A szignálpeptidet eltávolítjuk a folyamat során.

A szekretáit fehérjét azután csatlakozik a sejtmembrán egy C -terminális hidrofób régiót (HR) . A most membránhoz kapcsolódó fehérje hordozza azt az LPXTG felismerési motívumot, amelyhez a membránhoz kapcsolódó szortáz kötődik. A szortáz LPXTG motívumhoz való kötésével a hidrofób régió szétválik és átmeneti állapot jön létre, amelyben a szortáz a fehérjéhez kapcsolódik.

Az átmeneti állapot reakciója a II lipid szabad pentaglicin-maradékával (a peptidoglikán építőelemek prekurzora) a szekretált fehérje kovalensen rögzül a sejtfal-építőelemhez (lipid II). Amint a sejtfal szintézise folytatódik, a fehérje a peptidoglikán réteg részévé válik.

Alkalmazások

Fluoreszcens jelölés: A fehérjék fluoreszcensen jelölhetők szortázok segítségével

Gyűrűzáródás: A fehérje végei szortáz reakcióval kapcsolódhatnak egymáshoz

A szortázokat a biotechnológiában a molekulák összekapcsolására használják, és így a funkcióikat térben összekapcsolják. Nemcsak fehérjék kapcsolhatók össze, hanem lipidek és más molekulák is. Ennek előfeltétele, hogy a szortáz felismerési szekvenciái kapcsolódhassanak a molekulákhoz. A motívumoknak szintén helyesen kell orientálódniuk és térben hozzáférhetőknek kell lenniük a rendezés számára.

Fehérjék vagy egyéb molekulák lehet jelölni analitikai célokra segítségével sortases . Például, antitestek vagy receptor ligandumok lehet jelölt egy fluoreszcens festékkel , hogy megvizsgálják, valamint kötési tulajdonságaik.

Segítségével a szortáz reakció mechanizmusát, terápiás molekulák lehetnek PEG-ezett . A terápiás fehérje és a polietilénglikol (PEG) kombinálásával a fehérje lebomlása a szervezetben lelassulhat. A terápiás fehérje hosszabb biológiai felezési idejével javulnak a farmakodinamikai tulajdonságok.

A fehérje C- és N- terminálisának összekapcsolásával gyűrűzáródást érünk el. Ez gátolja a terápiás fehérjék proteázok általi lebontását . A PEGilációhoz hasonlóan ez a fehérje hosszabb biológiai felezési idejéhez vezet.

Többféle, különböző felismerési motívumú szortáz használata lehetővé teszi egy komplex szintézisét több ligandumból. Az egyes ligandumok orientációja és szekvenciája szabályozható.

A szortázok használatának előnyei

A szortázok enzimek és fiziológiai körülmények között működnek. Ezért, ellentétben néhány kémiai eljárással, a szortázok felhasználhatók anélkül, hogy a szubsztrátok károsodása (például hőmérséklet, pH-érték vagy sókoncentráció miatt) várható lenne.

A szortázok reakciója mindig specifikus, ami azt jelenti, hogy a szubsztrátok ligálása mindig ugyanazon a helyen történik. A kémiai szintézisben viszont a szubsztrátok időnként különböző pontokon kapcsolhatók össze.

A sortázok használatának hátrányai

A szortázok katalizálják az oda-vissza reakciót. Ez azt jelenti, hogy katalizálják a szubsztrátok összekapcsolódását és a kötés lazulását. Ennek az az oka, hogy az összekapcsolás helyreállítja a sortase felismerési motívumát. Ennek eredményeként a szubsztrátok és a termék közötti reakcióegyensúly bizonyos idő után létrejön . A szortáz reakció termékhozama a szubsztrátok tulajdonságaitól függ, és az átalakítás általában nem teljes.

A termék tisztítása a reakcióelegyből szintén problematikus lehet. Ez azonban nagymértékben függ a felhasznált hordozóktól is, ezért nem értékelhető átfogóan.

A szortázok a terápiás alkalmazások célpontjaként

A szortázok nagy mértékben felelősek a gram-pozitív baktériumok sejtfalának felépítéséért. A szortázisok által felépített felületi struktúrák sok virulencia tényezőt is tartalmaznak, amelyek z. B. szükséges az anyagcsere a baktériumokat vagy az adhézió az emberi szövetek. Tanulmányok kimutatták, hogy azok a kórokozók, amelyek szortázait genetikailag inaktiválták, már nem képesek fertőzéseket kiváltani. Ebből arra lehet következtetni, hogy a szortázok gyógyszeres gátlása antibiotikum terápiát jelenthet.

Egyéni bizonyíték

1. ↑ SK Mazmanian, G. Liu, ER Jensen, E. Lenoy, O. Schneewind: Staphylococcus aureus sortase mutánsok hibásak a felszíni fehérjék megjelenítésében és az állati fertőzések patogenezisében. In: A Nemzeti Tudományos Akadémia közleményei . 97. évfolyam , 10. szám, 2000. május, ISSN  0027-8424 , 5510-5515 . O., Doi: 10.1073 / pnas.080520697 , PMID 10805806 , PMC 25859 (ingyenes teljes szöveg).
2. ↑ ^{a b} Ki-Bong Oh és mtsai. : A szortáz-mediált Staphylococcus aureus fibronektinhez való adhéziójának gátlása a fibronektin-kötő fehérjével a sortáz inhibitorokkal. In: Alkalmazott mikrobiológia és biotechnológia . 70, 2006. 1. szám, 102–106.
3. ↑ ^{a b c} Markus Hilleringmann et al. : Streptococcus pneumoniae TIGR4 pili molekuláris felépítése. In: Az EMBO folyóirat . 28., 2009. sz. 24. szám, 3921-3930.
4. ↑ ^{a b} Luciano A. Marraffini, Andrea C. Dedent és Olaf Schneewind: Sortázok és a fehérjék gramm-pozitív baktériumok burkolatába történő lehorgonyzásának művészete. In: Mikrobiológiai és molekuláris biológiai áttekintések: MMBR. 70, 2006. 1. szám, 192–221.
5. ↑ Stella Cascioferro, Makrina Totsika és Domenico Schillaci: A Sortase: ideális célpont az antivirulencia gyógyszerek fejlesztésére. In: Mikrobiális patogenezis. 77 2014, 105–112.
6. ↑ CS Theile, MD Witte, AE Blom, L. Kundrat, HL Ploegh, CP Guimaraes: A fehérjék helyspecifikus N-terminális jelölése szortáz-közvetített reakciók alkalmazásával. In: Természeti protokollok. 8. évfolyam , 9. szám, 2013. szeptember, ISSN  1750-2799 , 1800-1807. O. , Doi: 10.1038 / nprot.2013.102 , PMID 23989674 , PMC 3941705 (ingyenes teljes szöveg).
7. ↑ U. Ilangovan és mtsai. : A szortáz szerkezete, a transzpeptidáz, amely a fehérjéket a Staphylococcus aureus sejtfalához rögzíti. In: A Nemzeti Tudományos Akadémia közleményei . 98, 11. szám, 2001, 6056-6061.
8. B ^{a b} M. J. Pallen és mtsai. : A szortázok zavara - szubsztrátok gazdagsága? In: A mikrobiológia trendjei. 9, 3. szám, 2001, 97–102.
9. ↑ ^{a b} Thomas Spirig, Ethan M. Weiner és Robert T. Clubb: szortáz enzimek Gram-pozitív baktériumok ellen. In: Molekuláris mikrobiológia. 82, 5. szám, 2011, 1044-1059.
10. ↑ Jonathan M. Budzik, Luciano A. Marraffini és Olaf Schneewind: A piliák összeszerelése a Bacillus cereus vegetatív sejtjeinek felületén. In: Molekuláris mikrobiológia. 66, 2. szám, 2007, 495-510.
11. B ^{a b} Gavin K. Paterson és Timothy J. Mitchell: Gram-pozitív sortáz enzimek biológiája. In: A mikrobiológia trendjei. 12, 2004. 2. szám, 89–95.
12. ↑ John M. Antos et al. : A fehérjék lipidmódosítása szortáz-katalizált transzpeptidálás útján. In: Az American Chemical Society folyóirata . 130, 48. szám, 2008, 16338-16343.
13. ↑ Maximilian W. Popp és mtsai. : Válogatás: sokoldalú módszer a fehérje jelölésére. In: Természet Kémiai Biológia . 3, 2007. 11. szám, 707-708
14. ↑ ^{a b} Maximilian W. Popp és mtsai. : Szortáz-katalizált transzformációk, amelyek javítják a citokinek tulajdonságait. In: A Nemzeti Tudományos Akadémia közleményei . 108. szám, 2011, 8. szám, 3169-3174.
15. ↑ John M. Antos és mtsai. : Egyetlen polipeptid helyspecifikus N- és C-terminális jelölése különböző specifitású szortázok alkalmazásával. In: Az American Chemical Society folyóirata. 131., 2009. sz. 31., 10800-10801.
16. ↑ Sarkis K. Mazmanian et al. : A vas által szabályozott szortáz a felületi fehérje egy csoportját lehorgonyozza a Staphylococcus aureus patogenezise során. In: A Nemzeti Tudományos Akadémia közleményei . 99, 4. szám, 2002, 2293-2298.
17. ↑ Anthony W. Maresso és Olaf Schneewind: A szortáz az antiinfektív terápia célpontjaként. In: Farmakológiai vélemények . 60, 1. szám, 2008, 128–141.