R -sløjfe - R-loop
En R-loop er en trestrenget nukleinsyrestruktur, der består af en DNA: RNA- hybrid og det tilhørende ikke-template-enkeltstrengede DNA . R-sløjfer kan dannes under forskellige omstændigheder og kan tolereres eller ryddes af cellulære komponenter. Udtrykket "R-loop" blev givet for at afspejle ligheden mellem disse strukturer og D-loops ; "R" i dette tilfælde repræsenterer involvering af en RNA -del .
I laboratoriet kan R-loops også skabes ved hybridisering af modent mRNA med dobbeltstrenget DNA under betingelser, der favoriserer dannelsen af en DNA-RNA-hybrid; i dette tilfælde danner intronregionerne (som er blevet splejset ud af mRNA) enkeltstrengede DNA-sløjfer, da de ikke kan hybridisere med komplementær sekvens i mRNA.
Historie
R-looping blev først beskrevet i 1976. Independent R-looping undersøgelser fra laboratorier Richard J. Roberts og Phillip A. Sharp viste, at protein -kodende adenovirus -gener indeholdt DNA-sekvenser, som ikke var til stede i den modne mRNA. Roberts og Sharp blev tildelt Nobelprisen i 1993 for uafhængigt at opdage introner. Efter deres opdagelse i adenovirus blev introner fundet i en række eukaryote gener, såsom det eukaryote ovalbumin -gen (først af O'Malley -laboratoriet, derefter bekræftet af andre grupper), hexon -DNA og ekstrakromosomale rRNA -gener af Tetrahymena thermophila .
I midten af 1980'erne åbnede udviklingen af et antistof, der specifikt binder sig til R-loopstrukturen, døren for immunfluorescensundersøgelser samt genomomfattende karakterisering af R-loop-dannelse ved DRIP-seq .
R-loop kortlægning
R-loop mapping er en laboratorieteknik, der bruges til at skelne introner fra exoner i dobbeltstrenget DNA. Disse R-sløjfer visualiseres ved elektronmikroskopi og afslører intronområder i DNA ved at oprette ubundne sløjfer ved disse regioner.
R-sløjfer in vivo
Potentialet for R-sløjfer til at tjene som replikationsprimere blev demonstreret i 1980. I 1994 blev R-sløjfer påvist at være til stede in vivo gennem analyse af plasmider isoleret fra E. coli- mutanter, der bærer mutationer i topoisomerase . Denne opdagelse af endogene R-sløjfer, i forbindelse med hurtige fremskridt inden for genetiske sekventeringsteknologier , inspirerede til en blomstring af R-loop-forskning i begyndelsen af 2000'erne, der fortsætter den dag i dag.
Regulering af R-loop-dannelse og opløsning
RNaseH- enzymer er de primære proteiner, der er ansvarlige for opløsningen af R-sløjfer og virker til at nedbryde RNA-delen for at tillade de to komplementære DNA-tråde at annealere. Forskning i løbet af det sidste årti har identificeret mere end 50 proteiner, der ser ud til at påvirke R-loop-akkumulering, og mens mange af dem menes at bidrage ved at sekvestrere eller behandle nyligt transskriberet RNA for at forhindre genglødning til skabelonen, mekanismer for R-loop interaktion for mange af disse proteiner mangler at blive bestemt.
R-loops roller i genetisk regulering
R-loop-dannelse er et centralt trin i immunoglobulin-klasseskift , en proces, der tillader aktiverede B-celler at modulere antistofproduktion . De ser også ud til at spille en rolle i at beskytte nogle aktive promotorer mod methylering . Tilstedeværelsen af R-sløjfer kan også hæmme transkription. Derudover ser R-loop-dannelse ud til at være forbundet med "åbent" kromatin , karakteristisk for aktivt transkriberede områder.
R-sløjfer som genetisk skade
Når der ikke dannes uplanlagte R-sløjfer, kan de forårsage skade ved en række forskellige mekanismer. Frilagt enkeltstrenget DNA kan blive angrebet af endogene mutagener, herunder DNA-modificerende enzymer, såsom aktiveringsinduceret cytidindeaminase , og kan blokere replikationsgafler for at fremkalde gaffelkollaps og efterfølgende dobbeltstrengede brud. R-loops kan også fremkalde uplanlagt replikation ved at virke som en primer .
R-loop akkumulering har været forbundet med en række sygdomme, herunder amyotrofisk lateral sklerose type 4 (ALS4) , ataxia oculomotor apraxia type 2 (AOA2) , Aicardi – Goutières syndrom , Angelman syndrom , Prader-Willi syndrom og kræft.
R-sløjfer, introner og DNA-skader
Introns er ikke-kodende regioner inden for gener , der transkriberes sammen med de kodende områder af gener, men efterfølgende fjernes fra det primære RNA-transkript ved splejsning . Aktivt transskriberede DNA- områder danner ofte R-sløjfer, der er sårbare over for DNA-skader . Introns reducerer dannelsen af R-loop og DNA-skader i stærkt udtrykte gærgener. Genomomfattende analyse viste, at intronholdige gener viser reducerede R-loop-niveauer og reduceret DNA-skade sammenlignet med intron-mindre gener med lignende ekspression i både gær og mennesker. Indsættelse af en intron i et R-loop-tilbøjeligt gen kan også undertrykke dannelse og rekombination af R-loop . Bonnet et al. (2017) spekulerede på, at introns funktion i opretholdelse af genetisk stabilitet kan forklare deres evolutionære vedligeholdelse på bestemte steder, især i stærkt udtrykte gener.
