MicroRNA -sekventering - MicroRNA sequencing

MicroRNA sekventering (miRNA-seq) , en type RNA-Seq , er brugen af næste generation sekventering eller massiv parallel high-throughput DNA-sekventering til sekvens microRNA , også kaldet miRNA. miRNA-seq adskiller sig fra andre former for RNA-seq ved at inputmateriale ofte er beriget til små RNA'er. miRNA-seq giver forskere mulighed for at undersøge vævsspecifikke ekspressionsmønstre, sygdomsforeninger og isoformer af miRNA'er og opdage tidligere ukarakteriserede miRNA'er. Bevis for, at dysregulerede miRNA'er spiller en rolle ved sygdomme som kræft, har positioneret miRNA-seq til potentielt at blive et vigtigt redskab i fremtiden til diagnostik og prognostik, da omkostningerne fortsat falder. Ligesom andre miRNA-profileringsteknologier har miRNA-Seq både fordele (sekvensuafhængighed, dækning) og ulemper (høje omkostninger, infrastrukturkrav, løbetid og potentielle artefakter ).

Introduktion

MicroRNA'er (miRNA'er) er en familie af små ribonukleinsyrer, 21-25 nukleotider i længden, der modulerer proteinekspression gennem transkriptnedbrydning, inhibering af translation eller sekvestrering af transkripter. Det første miRNA, der blev opdaget, lin-4 , blev fundet i en genetisk mutageneseskærm for at identificere molekylære elementer, der styrer den postembryoniske udvikling af nematoden Caenorhabditis elegans . Den lin-4 gen kodet en 22 nukleotid RNA med sites konserveret komplementær binding i 3'-utranslaterede region af lin-14 -mRNA -transkript og nedreguleret LIN-14-proteinekspression. miRNA'er menes nu at være involveret i reguleringen af ​​mange udviklingsmæssige og biologiske processer, herunder hæmatopoiesis ( miR-181 i Mus musculus ), lipidmetabolisme ( miR-14 i Drosophila melanogaster ) og neuronal udvikling ( lsy-6 i Caenorhabditis elegans ). Disse opdagelser nødvendiggjorde udvikling af teknikker, der var i stand til at identificere og karakterisere miRNA'er, såsom miRNA-seq.

Historie

MicroRNA-sekventering (miRNA-seq) blev udviklet for at drage fordel af næste generations sekventering eller massivt parallelle sekvenseringsteknologier med høj gennemstrømning for at finde nye miRNA'er og deres ekspressionsprofiler i en given prøve. miRNA -sekventering i sig selv er ikke en ny idé, de første metoder til sekventering anvendte Sanger -sekventeringsmetoder . Sekventeringsforberedelse involverede oprettelse af biblioteker ved kloning af DNA reverse transskriberet fra endogene små RNA'er med en størrelse på 21-25 bp valgt ved søjle- og gelelektroforese . Denne metode er imidlertid udtømmende med hensyn til tid og ressourcer, da hver klon skal forstærkes individuelt og forberedes til sekventering. Denne metode favoriserer også utilsigtet miRNA'er, der er stærkt udtrykte. Næste generations sekventering eliminerer behovet for sekvensspecifikke hybridiseringsprober, der kræves i DNA-mikroarrayanalyse samt besværlige kloningsmetoder, der kræves i Sanger-sekventeringsmetoden. Derudover letter næste generations sekventeringsplatforme i miRNA-SEQ-metoden sekventering af store puljer af små RNA'er i en enkelt sekventeringskørsel.

miRNA-seq kan udføres ved hjælp af en række sekventeringsplatforme. Den første analyse af små RNA'er ved hjælp af miRNA-seq-metoder undersøgte cirka 1,4 millioner små RNA'er fra modelplanten Arabidopsis thaliana ved hjælp af Lynx Therapeutics 'Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) sekventeringsplatform. Denne undersøgelse demonstrerede potentialet i nye sekvenseringsteknologier med høj gennemstrømning til undersøgelse af små RNA'er, og det viste, at genomer genererer et stort antal små RNA'er med planter som særligt rige kilder til små RNA'er. Senere undersøgelser anvendte andre sekventeringsteknologier, såsom en undersøgelse i C. elegans, der identificerede 18 nye miRNA-gener samt en ny klasse af nematoder små RNA'er betegnet 21U-RNA'er . En anden undersøgelse, der sammenlignede små RNA -profiler af humane cervikale tumorer og normalt væv, udnyttede Illumina (firma) genomanalysatoren til at identificere 64 nye humane miRNA -gener samt 67 differentielt udtrykte miRNA'er. Applied Biosystems SOLiD -sekventeringsplatform er også blevet brugt til at undersøge den prognostiske værdi af miRNA'er til påvisning af human brystkræft.

Metoder

Lille RNA -forberedelse

Konstruktion af sekvensbibliotek kan udføres ved hjælp af en række forskellige kits afhængigt af platformen med høj kapacitet, der anvendes. Der er imidlertid flere almindelige trin til forberedelse af små RNA -sekventeringer.

Total RNA -isolation

I en given prøve ekstraheres og isoleres alt RNA ved hjælp af en isothiocyanat/phenol/chloroform (GITC/phenol) metode eller et kommercielt produkt, såsom Trizol ( Invitrogen ) reagens. En startmængde på 50-100 ug totalt RNA, 1 g væv giver typisk 1 mg samlet RNA, er normalt påkrævet til gelrensning og valg af størrelse. Kvalitetskontrol af RNA måles også, f.eks. Ved at køre en RNA -chip på Caliper LabChipGX ( Caliper Life Sciences ).

Størrelse Fraktionering af små RNA'er ved gelelektroforese

Isoleret RNA køres på en denaturerende polyacrylamidgel. En billeddannelsesmetode, såsom radioaktive 5'-32P-mærkede oligonukleotider sammen med en størrelsesstige, bruges til at identificere en sektion af gelen indeholdende RNA af den passende størrelse, hvilket reducerer mængden af ​​materiale, der i sidste ende sekventeres. Dette trin behøver ikke nødvendigvis at blive udført før ligering og revers transkriptionstrin beskrevet nedenfor.

Ligation

Ligeringstrinnet tilføjer DNA -adaptere til begge ender af de små RNA'er, der fungerer som primerbindingssteder under revers transkription og PCR -amplifikation. En adenyleret enkeltstrenget DNA 3'adaptor efterfulgt af en 5'adaptor ligeres til de små RNA'er under anvendelse af et ligerende enzym, såsom T4 RNA ligase2. Adapterne er også designet til at fange små RNA'er med en 5' -phosphatgruppe, karakteristiske mikroRNA'er, frem for RNA -nedbrydningsprodukter med en 5' -hydroxylgruppe.

Omvendt transskription og PCR -forstærkning

Dette trin konverterer de små adapter -ligerede RNA'er til cDNA -kloner, der anvendes i sekventeringsreaktionen. Der er mange kommercielle kits til rådighed, der vil udføre dette trin ved hjælp af en eller anden form for revers transkriptase . PCR udføres derefter for at forstærke puljen af ​​cDNA -sekvenser. Primere designet med unikke nukleotid -tags kan også bruges i dette trin til at oprette ID -tags i poolet biblioteksmultiplex -sekventering.

Sekventering

Den faktiske RNA -sekventering varierer betydeligt afhængigt af den anvendte platform. Tre almindelige næste generations sekventeringsplatforme er Pyrosequencing på 454 Life Sciences- platformen, polymerase-baseret sekvens-ved-syntese på Illumina (virksomheds) platformen eller sekventering ved ligering på ABI Solid Sequencing- platformen.

Dataanalyse

Centralt i miRNA-seq dataanalyse er evnen til 1) at opnå miRNA-overflodniveauer fra sekvenslæsninger, 2) opdage nye miRNA'er og derefter kunne 3) bestemme det differentielt udtrykte miRNA og deres 4) associerede mRNA-genmål.

miRNA Alignment & Abundance Quantification

miRNA'er kan fortrinsvis udtrykkes i visse celletyper, væv, udviklingstrin eller især sygdomstilstande såsom kræft. Da dyb sekventering (miRNA-seq) genererer millioner af læsninger fra en given prøve, giver det os mulighed for at profilere miRNA'er; om det kan være ved at kvantificere deres absolutte overflod, for at opdage deres varianter (kendt som isomirs ) Bemærk, at i betragtning af at den gennemsnitlige længde af sekvenslæsninger er længere end den gennemsnitlige miRNA (17-25 nt), er 3 'og 5' enderne af miRNA'et skal findes på samme læsning. Der er flere miRNA overflod kvantificeringsalgoritmer. Deres generelle trin er som følger:

1. Efter sekventering filtreres rå sekvenslæsninger baseret på kvalitet. Adaptersekvenserne trimmes også af de rå sekvenslæsninger.
2. De resulterende læsninger formateres derefter til en fasta -fil, hvor kopienummeret og sekvensen registreres for hvert unikt tag.
3. Sekvenser, der kan repræsentere E. Coli -kontaminering, identificeres ved en BLAST -søgning mod en E. Coli -database og fjernes fra analysen.
4. Hver af de resterende sekvenser er justeret mod en miRNA -sekvensdatabase (såsom miRBase) For at tage højde for ufuldkommen DICER -behandling er et 6nt overhæng i 3' -enden og 3nt i 5' -enden tilladt.
5. De læsninger, der ikke er i overensstemmelse med miRNA -databasen, justeres derefter løst til miRNA -forstadier for at detektere miRNA'er, der kan bære mutationer eller dem, der har gennemgået RNA -redigering .
6. Læsetællingerne for hvert miRNA normaliseres derefter til det samlede antal kortlagte miRNA'er for at rapportere overflod af hvert miRNA.

Ny miRNA Discovery

En anden fordel ved miRNA-seq er, at det tillader opdagelse af nye miRNA'er, der kan have unddraget traditionelle screenings- og profileringsmetoder. Der er flere nye miRNA -opdagelsesalgoritmer. Deres generelle trin er som følger:

1. Få læsninger, der ikke var i overensstemmelse med kendte miRNA -sekvenser, og kortlæg dem til genomet.
2. RNA -foldemetode
   1. For miRNA -sekvenserne var en nøjagtig matchning fundet, opnå den genomiske sekvens inklusive ~ 100bp flankerende sekvens på hver side, og kør RNA gennem RNA -foldningssoftware, såsom Wien -pakken.
   2. Foldede sekvenser, der ligger på den ene arm af miRNA -hårnålen og har en minimum fri energi på mindre end ~ 25 kcal/mol, er shortlistet som formodet miRNA.
   3. De shortlistede sekvenser trimmes ned til kun at omfatte den mulige precursorsekvens og foldes derefter om for at sikre, at precursoren ikke blev kunstigt stabiliseret af nabosekvenser.
   4. De resulterende foldede sekvenser betragtes som nye miRNA'er, hvis miRNA -sekvensen falder inden for en arm af hårnålen og er stærkt konserveret mellem arter.
3. Star Strand Expression Method (miRdeep)
   1. Nye miRNA -sekvenser identificeres baseret på det karakteristiske udtryksmønster, de viser på grund af DICER -behandling: højere ekspression af det modne miRNA over stjernestrengen og loop -sekvenserne.

Differentiel udtryksanalyse

Efter at mængderne af miRNA'er er kvantificeret for hver prøve, kan deres ekspressionsniveauer sammenlignes mellem prøver. Man ville derefter være i stand til at identificere miRNA, der fortrinsvis udtrykkes ved bestemte tidspunkter, eller i bestemte væv eller sygdomstilstande. Efter at have normaliseret for antallet af kortlagte læsninger mellem prøverne, kan man bruge et væld af statistiske tests (som dem, der bruges i genekspressionsprofilering ) til at bestemme differentialekspression

Målforudsigelse

Identifikation af et miRNAs mRNA -mål vil give en forståelse af gener eller netværk af gener, hvis udtryk de regulerer. Offentlige databaser giver forudsigelser af miRNA -mål. Men for bedre at skelne sande positive forudsigelser fra falske positive forudsigelser kan miRNA-seq-data integreres i mRNA-seq-data for at observere for miRNA: mRNA-funktionelle par. RNA22, TargetScan , miRanda og PicTar er software designet til dette formål. En liste over forudsigelsessoftware findes her . De generelle trin er:

1. Bestem miRNA: mRNA-bindingspar, komplementaritet mellem miRNA-sekvenserne ved 3'-UTR i mRNA-sekvensen er identificeret.
2. Bestem graden af ​​bevarelse af miRNA: mRNA -bindingspar på tværs af arter. Typisk er mere stærkt bindende par mindre tilbøjelige til at være falske positive forudsigelser.
3. Observer for tegn på miRNA-målretning i mRNA-seq- eller proteinekspressionsdata: hvor miRNA-ekspressionen er høj, bør gen- og proteinekspressionen af ​​dets målgen være lav.

Målvalidering for spaltede mRNA -mål

Mange miRNA'er fungerer til at dirigere spaltning af deres mRNA -mål; dette er især sandt i planter, og der er således udviklet sekvenseringsmetoder med høj gennemstrømning for at drage fordel af denne egenskab ved miRNA'er ved at sekvensere de uafkortede 3'-ender af spaltede eller nedbrudte mRNA'er. Disse metoder er kendt som Degradome -sekventering eller PARE. Validering af målspaltning i specifikke mRNA'er udføres typisk ved anvendelse af en modificeret version af 5 ' Rapid Amplification af cDNA-ender med en genspecifik primer.

Ansøgninger

Identifikation af nye miRNA'er

miRNA-seq har afsløret nye miRNA'er, der tidligere blev undgået i traditionelle miRNA-profileringsmetoder. Eksempler på sådanne fund er i embryonale stamceller, kyllingeembryoer, akut lymfoblastisk leukæmi, diffust stort b-celle lymfom og b-celler, akut myeloid leukæmi og lungekræft.

Sygdomsbiomarkører

Mikro RNA'er er vigtige regulatorer for næsten alle cellulære processer såsom overlevelse, spredning og differentiering . Det er derfor ikke uventet, at miRNA'er er involveret i forskellige aspekter af kræft gennem regulering af onco- og tumorsuppressorgenekspression . I kombination med udviklingen af ​​metoder til profilering med høj gennemløb er miRNA'er blevet identificeret som biomarkører for kræftklassificering, respons på terapi og prognose. Fordi miRNA'er regulerer genekspression, kan de også afsløre forstyrrelser i vigtige regulatoriske netværk, der muligvis driver en bestemt lidelse. Flere anvendelser af miRNA'er som biomarkører og forudsigere af sygdom er angivet nedenfor.

Tabel 1: Kræftundertyper kendetegnet ved mikroRNA'er

Kræft type	miRNA'er α	Ref.
Bryst
ER -status	miR-26a/b, miR-30 familie, miR-29b, miR-155, miR-342, miR-206, miR-191
PR -status	lad-7c, miR-29b, miR-26a, miR-30 familie, miR-520g
HER2/ neu -status	miR-520d, miR-181c, miR-302c, miR-376b, miR-30e
Lunge
Squamous vs ikke-squamous celle	miR-205
Små celle vs ikke-lille celle	miR-17-5p, miR-22, miR-24, miR-31
Gastrisk
Spredt vs tarm	miR-29b/c, miR-30 familie, miR-135a/b
Endometrial
Endometrioid vs livmoderpapillær	miR-19a/b, miR-30e-5p, miR-101, miR-452, miR-382, miR-15a, miR-29c
Renal
Klar celle vs papillær	miR-424, miR-203, miR-31, miR-126
Oncocytom vs chromophobe	miR-200c, miR-139-5p
Myelom
med t (14; 16)	miR-1, miR-133a
med t (4; 14)	miR-203, miR-155, miR-375
med t (11; 14)	miR-125a, miR-650, miR-184
Akut myeloid leukæmi
med t (15; 17)	miR-382, miR-134, miR-376a, miR-127, miR-299-5p, miR-323
med t (8; 21) eller inv (16)	lad-7b/c, miR-127
med NPM1 -mutationer	miR-10a/b, let-7, miR-29, miR-204, miR-128a, miR-196a/b
med FLT3 ITD	miR-155
Kronisk lymfatisk leukæmi
ZAP-70 niveauer og IgVH-status	miR-15a, miR-195, miR-221, miR-155, miR-23b
Melanom
med BRAF V600E	miR-193a, miR-338, miR-565
Lymfom
Spredt stort B -cellelymfom	har-miR-128, har-miR-129-3p, har-miR-152, har-miR-155, har-miR-185, har-miR-193a-5p, har-miR-196b, har-miR- 199b-3p, har-miR-20b, har-miR-23a, har-miR-27a, har-miR-28-5p, har-miR-301a, har-miR-331-3p, har-miR-365, har-miR-625, har-miR-9

^α Dette er ikke en omfattende liste over miRNA'er involveret i disse maligniteter.

Sammenligning med andre metoder til miRNA -profilering

Ulemperne ved at bruge miRNA-seq frem for andre metoder til miRNA-profilering er, at det er dyrere, generelt kræver en større mængde totalt RNA, involverer omfattende amplifikation og er mere tidskrævende end mikroarray- og qPCR-metoder. Samt synes miRNA-seq biblioteksforberedelsesmetoder at have systematisk præferencerepræsentation af miRNA-komplementet, og dette forhindrer nøjagtig bestemmelse af miRNA-overflod. Samtidig er fremgangsmåden hybridiseringsuafhængig og kræver derfor ikke a priori sekvensinformation. På grund af dette kan man opnå sekvenser af nye miRNA'er og miRNA -isoformer (isoMirs), skelne sekventielt lignende miRNA'er og identificere punktmutationer.

Platforms sammenligning af miRNA -profilering

Tabel 2: Platforms sammenligning af miRNA -profilering

	qPCR	Microarray	Sekventering
Gennemløbstid	~ 6 timer	~ 2 dage	1-2 uger
Total RNA påkrævet	500 ng	100-1.000 ng	500-5.000 ng
Dynamisk område registreret	Seks størrelsesordener	Fire størrelsesordener	Fem eller flere størrelsesordener
Infrastruktur og tekniske krav	Få	Moderat	Betydelig
Pris pr. Prøve (USD)	$ 400	$ 250– $ 350	$ 500– $ 700

Referencer