Hind III - HindIII

HindIII -restriktionsendonuklease
Krystallografisk struktur af HindIII -restriktionsendonukleasedimeren (cyan og grøn) kompleksbundet med dobbelt spiralformet DNA (brun) baseret på PDB : 2E52 -koordinaterne.
Identifikatorer
Symbol	RE_Hindiii
Pfam	PF09518
InterPro	IPR019043
Tilgængelige proteinstrukturer: Pfam   strukturer / ECOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum strukturresumé

Hin HindIII (udtales "hin D Three") er et type II stedspecifik deoxyribonuklease restriktionsenzym isoleret fra Haemophilus influenzae , som spalter DNA palindromsekvensen AAGCTT i nærværelse af cofaktoren Mg ²⁺ via hydrolyse .

Hin DIII restriktioner proces resulterer i dannelse af udhængende palindrome kohæsive ender.

Spaltningen af ​​denne sekvens mellem AA's resulterer i 5 'udhæng på DNA'et kaldet klæbrige ender :

5'-A | AGCT T-3 '

3'-TTCGA | A-5 '

Restriktionsendonukleaser bruges som forsvarsmekanismer i prokaryote organismer i restriktionsmodifikationssystemet . Deres primære funktion er at beskytte værtsgenomet mod invasion af fremmed DNA, primært bakteriofag -DNA. Der er også beviser, der tyder på, at restriktionsenzymerne kan fungere sammen med modifikationsenzymer som egoistiske elementer eller kan være involveret i genetisk rekombination og transposition .

Enzymstruktur

Bgl II katalytisk sted, der viser koordinationen af ​​Asp 84 og Mg ²⁺ med vand

Strukturen af ​​HindIII er kompleks og består af en homodimer. Ligesom andre type II-restriktionsendonukleaser menes det at indeholde en fælles strukturel kerne omfattende fire p-ark og en enkelt a-helix . Hver underenhed indeholder 300 aminosyrer, og den forudsagte molekylmasse er 34.950 Da. På trods af dette enzyms betydning i molekylærbiologi og DNA -teknologi er der kun lidt information tilgængelig om mekanismen for DNA -genkendelse og fosfodiesterbindingsspaltning . Det menes imidlertid, at HindIII anvender en fælles mekanisme til genkendelse og katalyse af DNA, der findes i andre type II -enzymer, såsom Eco RI , Bam HI og Bgl II . Disse enzymer indeholder aminosyresekvensmotivet PD- (D/E) XK for at koordinere Mg ²⁺ , en kation, der er nødvendig for at spalte DNA i de fleste type II-restriktionsendonukleaser. Cofaktoren Mg ²⁺ menes at binde vandmolekyler og bære dem til katalytiske steder af enzymerne, blandt andre kationer. I modsætning til de fleste dokumenterede type II -restriktionsendonukleaser er HindIII unik ved, at den har ringe eller ingen katalytisk aktivitet, når Mg ²⁺ er substitueret med andre kofaktorer, såsom Mn ²⁺ .

Stedsstyret mutagenese

På trods af usikkerheden om struktur-katalyseforholdet mellem type II-endonukleaser, har stedstyret mutagenese af restriktionsendonukleasen HindIII givet meget indsigt i de involverede centrale aminosyrerester . Især substitutioner af Asn til Lys ved rest 125 og Leu til Asp ved rest 108 faldt betydeligt DNA-binding og den katalytiske funktion af Hin HindIII. I en separat mutagenesestudie blev det vist, at en mutation ved rest 123 fra Asp til Asn reducerede enzymatisk aktivitet. På trods af at denne rest sandsynligvis er ansvarlig for afvikling af DNA og koordinering til vand frem for direkte interaktion med den angribende nukleofil , er dens specifikke funktion ukendt.

Foreslået mekanisme

Mens restriktionsenzymer spalter ved specifikke DNA-sekvenser, skal de først bindes ikke-specifikt med DNA-rygraden, inden de lokaliseres til restriktionsstedet . I gennemsnit vil restriktionsenzymet danne 15-20 hydrogenbindinger med baserne i genkendelsessekvensen. Ved hjælp af andre van der Waals-interaktioner letter denne binding en konformationel ændring af DNA-enzymkomplekset, der fører til aktivering af katalytiske centre.

På trods af manglen på beviser, der tyder på en nøjagtig mekanisme til spaltning af DNA ved HindIII, har site-mutageneseanalyse kombineret med mere detaljerede undersøgelser af metalion-medieret katalyse i Eco RV ført til følgende foreslåede katalytiske mekanisme. Det er blevet foreslået, at under hydrolysen af ​​DNA ved EcoRV stabiliserer og orienterer den katalytiske remanens Lys-92 det angribende vand- nukleofil , mens carboxylatet af Asp-90 stabiliserer det udgående hydroxidanion til koordinering af Mg ²⁺ . Endvidere er enzymatisk funktion afhængig af Asp-74-restens korrekte position, hvilket tyder på, at den har en rolle i at øge nukleofiliciteten af ​​det angribende vandmolekyle.

Som følge af de site-mutageneseforsøg tidligere skitseret, er det derfor foreslået, at Lys-125, Asp-123, og Asp-108 i HindIII funktion svarende til Lys-92, Asp-90, og Asp-74 i EcoRV henholdsvis . Lys-125 placerer det angribende vandmolekyle, mens Asp-108 forbedrer dets nukleofilicitet. Asp-123 koordinerer til Mg2+, som igen stabiliserer den afgående hydroxidion.

Anvendelser inden for forskning

HindIII såvel som andre type II restriktionsendonukleaser er meget nyttige i moderne videnskab, især i DNA -sekventering og kortlægning. I modsætning til type I restriktionsenzymer udfører type II restriktionsendonukleaser meget specifik spaltning af DNA. Type I -restriktionsenzymer genkender specifikke sekvenser, men spalter DNA tilfældigt på andre steder end deres genkendelsessted, hvorimod type II -restriktionsenzymer kun spalter på deres specifikke genkendelsessted. Siden deres opdagelse i begyndelsen af ​​1970'erne har restriktionsenzymer af type II revolutioneret måden forskere arbejder med DNA på, især inden for genteknik og molekylærbiologi .

Større anvendelser af type II -restriktionsenzymer omfatter genanalyse og kloning. De har vist sig at være ideelle modelleringssystemer til undersøgelse af protein-nukleinsyreinteraktioner, struktur-funktion-relationer og evolutionens mekanisme . De foretager gode assays til undersøgelse af genetiske mutationer ved deres evne til specifikt at spalte DNA for at tillade fjernelse eller indsættelse af DNA. Ved hjælp af restriktionsenzymer er forskere i stand til at modificere, indsætte eller fjerne specifikke gener , et meget kraftfuldt værktøj, især når det kommer til at ændre en organismes genom .

Referencer